线粒体DNA对Caco-2细胞通透性的影响及机制

李会会，王迪迪，杨 彬，袁静静，陈利雪，刘秋圆，丁 浩，梅 俏，刘晓昌

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种非特异性肠道炎症性疾病，以损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)为代表的炎症介质具有增加IBD中肠黏膜通透性的作用。研究表明，IBD中DAMPs(包括HMGB1、IL-33和mtDNA等)水平增加，通过不同机制导致IBD的黏膜炎症。mtDNA作为强致炎性的DAMPs，可与Toll样受体9(Toll-like receptor 9，TLR9)结合，激活炎症通路，参与肺部炎症和关节炎等疾病的炎症过程。外源性mtDNA可以增加大鼠肺灌注通透性，阻断TLR9可以抑制这一过程，表明mtDNA在肺内皮细胞屏障破坏中起关键作用。但mtDNA是否通过调控TLR9信号通路影响肠上皮细胞的通透性尚不明确，因此该研究在建立Caco-2细胞单层模型的基础上，探讨mtDNA是否通过调控TLR9信号通路影响IBD的肠黏膜通透性及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

C57BL/6J小鼠40只(雄性，6～8周)购自安徽省实验动物中心；肝素钠、胶原酶Ⅳ购自德国BioFroxx公司；Mitochondrial DNA Isolation Kit(ab65321)试剂盒购自英国Abcam公司；Caco-2人结直肠腺癌细胞购自中国科学院干细胞库；BI血清购自以色列生物科技公司；PBS、高糖DMEM培养基购自美国Hyclone公司；青霉素-链霉素混合液、非必须氨基酸、0.25%胰蛋白酶购自北京索莱宝生物科技有限公司；MILLICEL@-ERS购自美国MILLIPORE公司；Transwell inserts(型号3413)购自美国康宁公司；FITC-dextran(分子量3-5 ku)购自美国Sigma-adrich公司；多功能酶标仪购自美国PE公司；肿瘤坏死因子-ɑ(tumour necrosis factor-ɑ,TNF-ɑ)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒购自武汉新启迪生物科技有限公司、ODN TTAGGG(A151)购自美国Invivogen公司；TRIzol购自美国ambion公司；三氯甲烷购自上海西陇科学股份有限公司；DEPC水(RNase-free水)购自北京Biosharp公司；RT-PCR反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；Actin引物、TLR9引物由上海生工生物工程股份有限公司设计与合成；……