肺炎支原体P116基因FP2片段的免疫优势和细胞黏附活性

林 康，文 志，周 畅，李文丽，吴焕武，刘丹艳，朱玉林，王林定

肺炎支原体是一种原核细胞型微生物，是已知能够自我复制的最小的人类病原体，大约7%～20%的获得性肺炎病例是由该病原体引起的。肺炎支原体对宿主呼吸道黏膜上皮细胞的黏附和定植是成功感染的关键因素之一。这一过程由肺炎支原体的附着细胞器(adherent organelle，AO)所介导。AO是一种极化和锥形的细胞延伸，被认为与肺炎支原体滑动和细胞分裂有关。肺炎支原体黏附过程需要多种蛋白质的参与，包括P1、P2、P3、P116和P30以及高分子量(high molecular weight，HMW)蛋白。与其他表面黏附蛋白不同，P116不与P1、P30或HMW蛋白形成复合物，而是独立参与细胞黏附。P116蛋白由3 093 bp的开放阅读框编码，编码1 030个氨基酸，分子量为116 ku。该研究旨在对P116蛋白的敏感性、特异性和黏附介导区，作结构-功能研究，为提供临床诊断和治疗策略提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

A549细胞购于美国ATCC。肺炎支原体SP4快速培养基购于珠海迪尔生物技术有限公司、质粒提取试剂盒购于北京TIANGEN公司；QuickCut限制性内切酶EcoR l与BamH 1及其配套缓冲液购于北京Takara公司；Ni-NTA购于生工生物工程(上海)股份有限公司

1.2 方法

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肺炎支原体标准株的复苏培养 将肺炎支原体标准株(FH，ATCC 15531)接种于支原体培养液中，需氧培养，每日观察。当培养基颜色由红色变为橙色时，细菌处于指数生长期。收集细菌，用PBS洗涤，离心、静置，在PPLO琼脂平板上涂板，37 ℃、5% CO培养，每3 d进行10倍显微镜观察，可疑菌落用双烯染色，镜下观察和PCR鉴定。

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重组质粒PQE-P116-FP2的构建 参照文献设计P116-FP2基因引物,上游引物5-CCAAGTGGATCCCTGATCTCTTTGGCGAC-3；……