圈养环尾狐猴血常规两种检测方法的比较应用

朱向蕾，王瑛莹，周立晨

(上海动物园，上海 200335)

环尾狐猴(Lemurcatta)也称节尾狐猴，分布在非洲马达加斯加岛，在森林中生活。近些年来，狐猴的栖息地遭受严重破坏，种群数量减少[1-3]，国际自然保护联盟(IUCN)专家评估，94%狐猴濒临灭绝，其中就包括环尾狐猴，因此环尾狐猴的保护遗传研究刻不容缓[4-6]。

对血液参数的检测有助于对动物机体进行临床检查，解读动物的生理学、营养学和病理学状态[7-8]。另一方面，开展血液学检测有助于理解血液参数与动物生存环境之间的关系[9]，从而进一步评估动物个体对特定疾病和环境条件的抵抗力[10]。血常规作为血液检查最基础的部分，是判断机体是否处于正常状态的重要标准，意义重大。

目前，检测血常规常用方法有两种，一种是人工镜检法，另一种是仪器检验法。国外有应用手工方式进行环尾狐猴的血液学检验，白脚绢毛猴采用手动方法进行白细胞分类，对红细胞、白细胞计数进行了仪器测定[11]，对一些猕猴类的血常规，如食蟹猴的，直接采用仪器进行测定[12]。国内有关环尾狐猴的血常规指标检验大多依赖于仪器，并未对其可靠性进行进一步的验证。目前兽用血细胞分析仪种类型号很多，具有快速、稳定的特点，但环尾狐猴属于原始灵长类，其外形、生活习性、生长环境等均不同于普通实验猴，也有着不同于实验猴的生理生化特性。因此，常规血液分析仪检验环尾狐猴血常规的适用性有待进一步探索。

本研究以原始低等灵长类动物环尾狐猴为研究对象，通过两种检验方法对其血液参数进行测定，验证以猴血液为标本类型的仪器检验法针对环尾狐猴的可靠性和准确性，整合得出最佳检验方法，以便为圈养环尾狐猴的科学饲养和健康管理以及其疾病的临床诊断和治疗提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 样本采集自上海动物园圈养的10只健康环尾狐猴，雌雄各半，空腹静脉采集血液2 mL～4 mL，分装至有EDTA-K2抗凝剂和肝素-Li抗凝剂的抗凝管中，手动摇匀后冷藏待测。

1.1.2 主要试剂 血细胞分析用溶血剂(M-52DIFF溶血剂、M-52LH溶血剂)、探头清洁液，深圳迈瑞生物医疗有限公司产品；20 mL/L冰醋酸，国药集团化学试剂有限公司产品；9 g/L NaCl溶液，浙江都邦药业股份有限公司产品；甲醇，上海泰坦科技股份有限公司产品；瑞氏-吉姆萨染液，珠海贝索生物有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 兽用全自动血液分析仪(BC-5000 Vet)，深圳迈瑞生物医疗有限公司产品；显微镜(CX31)，奥林巴斯有限公司产品；离心机(Centrifuge 5424R)、移液枪(Eppendorf)，德国Eppendorf公司产品；血细胞计数板，德国Marienfeld公司产品；机械分类计数器，新康医疗有限公司产品。

1.2 方法

所有血液样本的处理分析与生理参数值测定均在上海动物园完成。

1.2.1 血液常规参数值仪器测定 将血液样本(EDTA-K2抗凝剂保存)放置室温，手动颠倒摇匀后，经兽用全自动血液分析仪检测血液生理指标，包括白细胞(white blood cell，WBC)计数、红细胞(red blood cell ，RBC)计数、单核细胞(monocyte，Mon)比率(Mon%)、中性粒细胞(neutrophil，Neu)比率(Neu%)、淋巴细胞(lymphocyte，Lym)比率(Lym%)、嗜酸性粒细胞(eosinophils，Eos)比率(Eos%)和嗜碱性粒细胞(basophil，Bas)比率(Bas%)共7项[13]，检验选用的标本类型为与环尾狐猴较为接近的猕猴，仪器测定前经过技术人员校正，以确保其准确性和稳定性[14]。

1.2.2 血液常规参数值手工计数 将血液样本(EDTA-K2抗凝剂保存)放置室温30 min，手动摇匀后，进行7项血液常规指标的测定[15]。

1.2.2.1 白细胞计数方法 20 mL/L冰醋酸将血液样本40倍稀释，振荡混匀后，取10 μL混合液滴入血细胞计数板中，400倍显微镜下计数并测算白细胞密度。

1.2.2.2 红细胞计数方法 用9 g/L NaCl溶液将血液样品400倍稀释，充分混匀后吸取10 μL混合液滴入血细胞计数板中，400倍显微镜下计数并测算红细胞密度。

1.2.2.3 白细胞分类计数方法 吸取2.5 μL环尾狐猴血液用载玻片制成6 cm×2.5 cm血涂片，经甲醇固定后，进行瑞氏-姬姆萨染色，油镜观察计数100个白细胞进行分类计数。

1.2.3 数据处理分析 对环尾狐猴血液生理生化参数进行分析，计量结果以平均值(Mean)、标准差(SD)表示，对测定的数据进行正态分布检验(样本量不足50，采用Shapiro-Wilk test)。在血液生理参数人工计数和仪器计数两种方法的比较过程中，均符合正态分布的数据应用配对样本T检验(Paired t-test)比较差异性，否则应用非参数检验(两个相关样本：Wilcoxon signed-rank test)比较差异性。符合正态分布的采用pearman进行相关性分析，不符合正态分布的采用Spearman进行分析。所有数据统计应用SPSS Statistics 23.0软件完成，显著水平设定为0.05。

2 结果

2.1 人工计数法与仪器检测法稳定性比较

根据采集环尾狐猴样本的细胞密度选取高、中、低值3组数据进行人工计数和仪器检测的稳定性分析，每组测定10个数据，测定其平均值、标准差和变异系数(表1)，结果发现，白细胞人工镜检的高、中、低值普遍高于仪器测定值，红细胞则相反，整体平均值差异不大，但是每组数据的变异系数，仪器检测法的低于人工镜检的，表明仪器检测稳定性及重复性较好。

表1 环尾狐猴血液样本两种方法测定低中高密度样本结果

2.2 人工镜检法与仪器法检测环尾狐猴血细胞计数比较

应用人工计数和仪器计数两种方法对收集的环尾狐猴血液样本进行血细胞计数，判定其差异性。两种方法检测WBC差异不显著(P>0.05)，RBC差异显著(P<0.05)(表2)。表明人工镜检法与仪器法应用于环尾狐猴的WBC结果基本一致，而RBC结果有显著差异。

表2 人工镜检和仪器检测血细胞统计结果

2.3 人工镜检法与仪器法进行环尾狐猴的白细胞分类计数

环尾狐猴血细胞在显微镜下观察形态如图1所示。在环尾狐猴白细胞分类计数结果中，两种方法测得环尾狐猴Lym%、Mon%、Eos%的数据符合正态分布(P>0.05)，Neu%、Bas%的数据为非正态分布，其中Lym%(P>0.05)、Neu%(P>0.05)两种方法测定结果无显著性差异,Mon%(P<0.05)、Eos%(P<0.05)和Bas%(P<0.05)两种方法统计结果为差异性显著(表3)。

表3 仪器法与人工镜检法检测白细胞分类计数的比较

1.红细胞；2.血小板；3.分叶核中性粒细胞；4.杆状核中性粒细胞；5.分叶核嗜酸粒细胞；6.杆状核嗜酸粒细胞；7.淋巴细胞；8.单核细胞。放大倍数1 000×

2.4 人工镜检法与仪器法检测环尾狐猴血细胞结果的相关性分析

分析两种环尾狐猴血细胞检测方法的相关性，结果见图2。结果发现，WBC(r=0.971，P=0)、Lym%(r=0.967,P=0)、Mon%(r=0.887,P=0.001)、Neu%(r=0.879,P=0.001)两种检测方法结果相关性显著，RBC(r=0.493,P=0.148)、Eos%(r=0.256，P=0.476)的结果呈弱相关或极弱相关，Bas%人工检测为常量，未作相关性分析。

图2 人工镜检法与仪器法检测结果的线性相关分析

3 讨论

血液参数能够提供有关动物营养、生理健康状况及免疫机能的参考信息，与动物机体的物质代谢和能量代谢水平直接相关，在一定程度上受环境因素、营养状态及疾病等因素的影响[16]。因此，准确快速的测定动物血液参数值，并理解其内涵对于判定动物的健康状况，开展饲养管理等具有十分重要的指导意义。

本研究在一定程度上得出了环尾狐猴血常规指标的参数值，其中WBC结果均低于易刚等[17]、韩飞[18]对环尾狐猴血常规指标的检测值，而白细胞分类计数差异不大，RBC与其结果相比，人工检验法较低，仪器检验法较高。与Singleton C L等[19]的检测结果相比，Lym%和Mon%检测值偏高，而Neu%检测值偏低，造成差异的原因可能是地域、饲料、环境、应激、不同季节饲养管理等因素的影响[20]，也可能是不同检测仪器之间的差异，例如动物营养不良或饲料中微量元素缺乏可能造成RBC或血红蛋白降低，应激时会引起动物WBC增高，炎热夏季时，动物饮水较多，使得血液浓度变低，继而相应血液指标也可能降低。

本研究通过人工镜检和仪器检测两种方法对环尾狐猴的血常规参数进行测定，通过稳定性测试发现仪器检测快速、稳定且重复性好，其中两种方法检测的WBC、Lym%及Neu%差异不显著，说明人工和仪器两种检验方法对3种血液指标的检测结果是一致的，进一步通过相关性分析发现，WBC、Lym%和Neu%的结果也具有很好的相关性，说明仪器检测在这些指标上与人工镜检法差异不显著且相关性较好，可在一定程度上代替人工镜检。然而，两种检验方法的RBC和Eos%结果差异显著且呈弱相关或极弱相关，表明二者结果的不一致性，仪器检测不能很好的进行以上指标的检测，必须结合人工镜检。RBC结果差异大的原因可能在于低等灵长类的节尾狐猴与一般实验性猕猴在红细胞形态及大小上的不同，猕猴的范围较大，造成计数结果偏高。因为Bas%很低，一般小于1%，这可能是人工镜检时均为零的原因，必要时可通过增加计数量来进一步分析其差异性和相关性。对白细胞分类结果比较发现，显著性差异大或相关性差的指标为所占比率较低的细胞，细胞比率低可能为其中差异性显著或相关性差的原因之一。

环尾狐猴属于原始灵长类，且属于珍稀野生动物，参考指标缺乏，因此仪器检测选用的标本类型为相近的猴，但考虑到其不同于普通实验性猕猴，用仪器进行检验时以实验猴数据为标准进行，这可能是在一些指标上结果差异显著的原因。因此，以猴为标本类型对环尾狐猴进行仪器检测并不能完全体现其真实情况，而且野生动物形态复杂，一些异常细胞仪器无法正确判断，必要时需要进行人工显微镜检[21]，比如一些异形淋巴细胞，需要与白血病幼稚和原始淋巴细胞进行仔细鉴别，人工镜检能及时发现血小板或红细胞凝集、异常细胞、寄生虫感染、染色质着色及细胞结构变化等情况并加以识别[22]，以便为临床兽医提供准确有效的判断根据。即使在相对成熟的人类医学检验中，血细胞分析作为最常用的项目之一，目前普遍使用仪器检测，大大提高了临床检验质量和效率，但是对一些贫血、白血病、感染等疾病诊断时仍需进行血涂片镜检。因此，目前对环尾狐猴血常规的临床检验，仍以仪器和人工镜检结合检验更为有效。