ULBP3联合CEA、CA125、SCCA在肺癌中的诊断价值

牟笑，罗旋，刘佳梦，董利阳，毛朝明，汪雪峰

(江苏大学附属医院 a.核医学科，b.中心实验室，江苏 镇江 212001)

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，以非小细胞肺癌最为常见，主要分为肺腺癌和肺鳞癌。我国每年新增肺癌患者78万，预计到2025年，肺癌患者将达到100万[1]。目前肺癌的发病原因尚不明确，实施对病因的一级预防比较困难，主要落实“早发现、早诊断、早治疗”的措施，而早期诊断是肺癌治疗和预后的关键。尽管癌胚抗原(carcinogenic embryonic antigen，CEA)、细胞角蛋白21-1、鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)、糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)、人胃泌素释放肽前体、CA199、神经元特异性烯醇化酶等肿瘤标志物应用于肺癌的诊断，但这些指标仍缺乏特异性、敏感性[2-6]。探寻简单、快速，敏感性高且特异性强的新型肺癌标志物，对肺癌的防治工作具有重要意义。

人类巨细胞病毒糖蛋白UL-16结合蛋白(UL-16 binding protein，ULBP)是自然杀伤细胞表面重要活化受体NKG2D(natural killer group 2,member D)的配体成员之一，在许多病毒感染及胃癌、结直肠癌、肺癌等恶性肿瘤细胞表面均表达上调，是一种重要的压力诱导蛋白。毛朝明等[7]前期研究发现，ULBP3在肺癌细胞株中高表达，且以可溶性蛋白的形式存在于细胞培养上清中，提示ULBP3可能对肺癌具有诊断价值。本研究主要分析ULBP3联合CEA、CA125、SCCA对肺癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年3月至2019年12月在江苏大学附属医院病理确诊的106例肺癌患者(腺癌70例、鳞癌36例)作为肿瘤组，其中男72例、女34例，年龄46～83岁，中位年龄62.2岁；肺癌病理分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期76例。肺癌分期依据国际抗癌联盟第七版肺癌TNM分期标准[8]，分型依据病理检查结果。同期选取肺部良性疾病患者56例(肺炎31例、慢性阻塞性肺疾病20例、间质性肺炎4例、气胸1例)作为对照组，其中男44例、女12例，年龄33～85岁，中位年龄67.1岁。肺癌组排除标准：已在外院接受手术、放化疗或免疫治疗者；患有其他恶性肿瘤、严重慢性病史。本研究获得江苏大学附属医院伦理委员会批准，患者均签署了知情同意书。

1.2方法 采集对照组和肺癌组患者的外周血3 mL，采用低温离心机以离心半径12 cm，4 000 r/min离心10 min，收集血清并储存于-80 ℃冰箱，用于集中检测。采用美国雅培i2000型全自动化学发光仪检测血清CEA、CA125水平，采用深圳新产业4000P型全自动化学发光仪检测血清SCCA水平，并使用原装配套试剂盒按照说明书进行操作。正常参考值：CEA<5 μg/L，CA125<35 kU/L，SCCA<2.5 μg/L。

采用时间分辨荧光免疫分析法检测血清ULBP3水平，以商品化人ULBP3重组蛋白(ULBP3-Fc)做标准蛋白，设0、10、20、50、100 μg/L 5个标准蛋白浓度，利用时间分辨荧光免疫分析方法绘制标准曲线。将冻干品平衡至室温，采用1 mL蒸馏水溶解；将所需数量的包被板条使用前平衡至室温；将浓缩洗涤液用蒸馏水1∶25倍稀释；将预先用Eu3+(铕)标记好的B4-C5-D11单抗1∶200倍稀释；按浓度由低到高在微孔板内依次加入每孔50 μL的参考标准品，每孔再加入150 μL缓冲液，25 ℃震荡孵育1 h，洗扳机洗涤4次，控干；每孔加入稀释好的Eu3+标记B4-C5-D11 200 μL，25 ℃震荡孵育1 h，洗扳机洗涤6次，控干；每孔加增强液200 μL，注意悬空加入，避免孔间污染，25 ℃震荡孵育5 min后用时间分辨荧光免疫分析仪测量；待测试运行结束后，退出样本，收回所用试剂于4～8 ℃保存，所用板条取出后弃掉。

2 结 果

2.1肺癌组与对照组血清CEA、CA125、SCCA、ULBP3水平比较 肺癌组血清CEA、CA125、SCCA、ULBP3水平高于对照组(P<0.05或P<0.01)，见表1。

表1 两组血清CEA、CA125、SCCA、ULBP3水平比较

2.2肺癌患者血清ULBP3表达水平与临床特征的关系 不同性别、年龄、病理类型、临床分期及有无吸烟史的肺癌患者血清ULBP3水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 肺癌患者血清ULBP3表达水平与临床特征的关系

2.3血清CEA、CA125、SCCA、ULBP3对肺癌的诊断价值 ROC曲线结果显示，ULBP3联合CEA、CA125、SCCA检测的曲线下面积(area under the curve，AUC)大于各指标单独检测，见图1。ULBP3联合CEA、CA125、SCCA诊断肺癌的灵敏度和特异度均高于各指标单独检测，见表3。

CEA：癌胚抗原；CA125：糖类抗原125；SCCA：鳞状上皮细胞癌抗原；ULBP3：UL-16结合蛋白3；ROC：受试者工作特征曲线

表3 血清CEA、CA125、SCCA、ULBP3对肺癌的诊断效能评价

2.4血清CEA、CA125、ULBP3对肺腺癌的诊断价值 ROC曲线结果显示，ULBP3联合CEA、CA125检测的AUC大于各指标单独检测或两两联合检测,见图2。ULBP3联合CEA、CA125诊断肺腺癌的灵敏度和特异度大于各指标单独检测和两两联合检测，见表4。

CEA：癌胚抗原；CA125：糖类抗原125；ULBP3：UL-16结合蛋白3；ROC：受试者工作特征曲线

表4 血清SCCA、CEA、ULBP3对肺腺癌的诊断效能评价

2.5血清SCCA、ULBP3对肺鳞癌的诊断价值 ROC曲线结果显示，ULBP3联合SCCA检测的AUC大于各指标单独检测，见图3。ULBP3联合SCCA诊断肺鳞癌的灵敏度和特异度高于各指标单独检测，见表5。

SCCA：鳞状上皮细胞癌抗原；ULBP3：UL-16结合蛋白3；ROC：受试者工作特征曲线

表5 血清SCCA、ULBP3对肺鳞癌的诊断效能评价

3 讨 论

肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌包括鳞癌、腺癌、大细胞癌等。与其他类型肺癌相比，以腺癌和鳞癌为主的非小细胞肺癌占80%以上，生长和转移扩散较慢，不易早期发现，其治疗主要以手术结合放化疗为主的综合治疗模式[9]。

CEA是一种细胞表面糖蛋白，与结肠癌等胚层组织癌细胞密切相关，肺癌患者血清CEA水平升高，检测血清中的CEA水平对肺癌的早期诊断、治疗效果评价、预后评估等具有一定的临床价值。有研究表明，肺癌、胃癌、乳腺癌等患者血清CEA水平升高，且CEA在非小细胞肺癌患者中的表达水平显著高于健康对照组[10]，本研究结果与上述研究一致。CA125是一种糖蛋白复合物，在卵巢癌患者血清中水平升高，在肺癌导致的恶性胸腔积液中高表达，也是肺癌辅助诊断的常用组合指标之一[11]。SCCA是从鳞状上皮细胞来源的癌组织细胞中提取到的抗原物质，研究发现SCCA在肺鳞癌中的表达水平显著高于健康对照组[12]。ULBP蛋白在许多病毒感染和恶性肿瘤细胞表面均表达上调，且在肠癌、肺癌、卵巢癌等癌细胞中表达[13-15]。

Mou等[16]前期研究发现，ULBP3在结肠癌、肺癌、食管癌等肿瘤细胞系中高表达，在胃癌、肺癌、食管癌患者血清中高表达，本研究结果与前期研究结果一致。中华医学会肺癌临床诊疗指南建议中提出，肿瘤标志物联合检测可提高肿瘤诊断的灵敏度和特异度[17]。本研究ROC曲线结果显示，ULBP3联合CEA、CA125、SCCA检测诊断肺癌的灵敏度和特异度高于各指标单独检测；ULBP3联合CEA、CA125检测诊断肺腺癌的灵敏度和特异度高于各指标单独检测。本研究结果显示，ULBP3诊断肺腺癌的灵敏度高于CEA，可能与本研究的检测方法有关，后续研究应建立基于化学发光反应原理的检测体系，与时间分辨免疫荧光分析法进行比较，进一步验证本研究的结论。Holdenrieder等[18]研究发现，SCCA能够鉴别健康人群、良性疾病和小细胞肺癌。血清SCCA水平升高提示非小细胞肺癌的可能性较大，特别是肺鳞癌，对于肺癌患者，SCCA联合其他生物标志物可提高诊断效能。本研究结果显示，ULBP3联合SCCA检测诊断肺鳞癌的灵敏度和特异度均高于SCCA单独检测。Chen等[19]研究发现，ULBP1对胰腺癌的早期诊断有重要价值，ULBP2可以作为评估胰腺癌患者风险的指标。Yamaguchi等[20]研究发现，游离型ULBP2是肺鳞癌的重要诊断标志物，可以作为进展型非小细胞肺癌的预测指标，本研究结果与上述研究基本一致。ULBP3与其他肿瘤标志物联合检测能够显著提高肺癌诊断的特异性和敏感性，因此ULBP3有望成为肺癌诊断的肿瘤标志物。

NKG2D配体家族成员ULBP蛋白在多种肿瘤中高表达，并以游离形式存在于肿瘤患者血清中，可通过调节自然杀伤细胞的杀伤活性参与肿瘤的发生发展过程。Osterburg等[21]研究发现在肺淋巴管平滑肌瘤病中，血清中游离ULBP2和ULBP3的含量增多，且与肺功能加速下降相关。游离形式的ULBP蛋白增多一方面是由于基质金属蛋白酶或磷脂酶C的溶蛋白性裂解作用所致，另一方面是通过溶酶体依赖的方式释放到胞外导致。而游离ULBP蛋白能够结合到自然杀伤细胞表面的NKG2D受体上，通过影响自然杀伤细胞受体的功能而影响其杀伤作用[22-23]。Guo等[24]研究发现，在鼻咽癌患者中，γ干扰素能够通过上调基质金属蛋白酶的合成促进膜表面ULBP3分子脱落，通过增加循环中游离ULBP3的含量抑制CD8+T细胞的杀伤功能。Kim等[25]研究发现，塞来昔布通过抑制环加氧酶2上调肺癌细胞系A549和H460细胞表面ULBP1-3的表达，进而增加癌细胞对自然杀伤细胞的敏感性。因此，ULBP蛋白在肿瘤细胞膜表面的表达水平和游离形式的ULBP3含量可以影响自然杀伤细胞或CD8+T细胞的杀伤活性，在肿瘤的发生发展中起重要作用。但游离形式的ULBP蛋白家族成员在各种肿瘤中的表达情况尚不明确。

综上所述，ULBP3作为新型标志物参与传统项目联合诊断，大大提高了肺癌的诊断效能。血清ULBP3有望作为肺癌早期诊断的标志物，但肺癌的明确诊断仍需要病理学依据。另外，本研究的样本量偏少，可能对结果产生影响，需要进一步大样本研究的证实。