支链氨基酸对奶牛体外胰腺消化酶分泌的影响及其交互作用

徐 明，马 轩，王梦雅,2，吴东霖，邵 凯，李 茹(.内蒙古农业大学 动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 0008；2.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 7200)

泌乳前期奶牛由于能量摄入无法满足代谢需求，常处于能量负平衡状态，对机体健康和生产性能产生一定负面影响。淀粉是高产反刍动物重要的能量来源，但饲喂大量淀粉会诱发瘤胃酸中毒等代谢性疾病[1-2]。研究表明，反刍动物小肠降解淀粉的能量利用率比在瘤胃中发酵高42%[3-4]。但小肠消化淀粉的能力有限，胰腺α-淀粉酶分泌不足是限制小肠淀粉利用的关键因素[4-5]。因此，改善胰腺外分泌功能对提高反刍动物小肠淀粉的消化、满足能量需求、维持机体健康具有重要意义。

Swanson等[6]发现，增加日粮蛋白质含量可提高安格斯育肥牛胰腺α-淀粉酶的分泌，这与蛋白质中的氨基酸组成有关。支链氨基酸(BCAAs)包括亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)，这些氨基酸不能在动物体内合成，只能通过饲粮获取。BCAAs是蛋白质合成的底物，还具有调节能量分配、葡萄糖代谢以及激素分泌等多种生物学功能[7-9]。前期试验表明，十二指肠灌注亮氨酸可以增加关中青年山羊和荷斯坦青年牛胰腺消化酶的分泌[10-11]。研究发现，适当提高缬氨酸浓度可以提高草鱼淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的分泌[12]。目前对3种BCAAs影响胰腺外分泌功能的具体剂量效应及其交互作用尚无报道。

鉴于此，本试验通过体外组织培养的方法，研究BCAAs对荷斯坦奶牛胰腺消化酶分泌的影响及其交互作用，旨在为提高小肠淀粉利用效率、减少饲料资源浪费提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

1.1.1 试验1 BCAAs浓度对奶牛胰腺消化酶分泌的影响 将5头荷斯坦奶牛于呼和浩特北亚清真肉食品有限责任公司屠宰后，取出胰腺，用4 ℃的生理盐水冲洗，并置于4 ℃的盐水中迅速转移至实验室。将组织置于冰上进行组织剥离，切成2×2 mm的小块组织(约0.1 g)，用滤纸吸干，并用玻璃皿称重。培养组织方法与Swanson等[13]方法相同。将组织块放入分别含有0、2.62、5.24和10.48 mg/mL亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的Krebs Ringer bicarbonate buffer(KRB)溶液中进行组织块培养，每个处理5个重复，于39 ℃水浴摇床中培养，振荡频率90次/ min，培养60 min。将所有培养液的pH调至7.4。

1.1.2 试验2 3种BCAAs对奶牛胰腺消化酶分泌的交互影响 将5头荷斯坦奶牛屠宰后，收集胰腺组织，其处理方法与试验1相同。采用2×2×2的3因素、2梯度试验设计，3种BCAAs浓度分别为0和5.24 mg/mL，共8个处理，每个处理5个重复。培养方法同试验1。

1.2 样品收集与分析

培养结束后，取出培养板置于冰上。用移液枪从每个培养孔中吸取700 μL KRB培养液置于带标记的无菌无酶冻存管中，-20 ℃保存。将组织单独取出在盐水中匀浆，储存于冻存管中标记，于-20 ℃冰箱保存。

于1周内用试剂盒(南京建成生物工程研究所)分析消化酶的活性。酶活性以活性单位表示，1个单位定义为39 ℃下每分钟释放1 μmol产物。

组织释放(IU/g)=(KRB培养液(mL)×酶活性(IU/mL))/组织重量(g)

1.3 统计分析

通过SAS 9.2 的一般线性模型程序分析消化酶活性数据。试验1使用单因素方差分析(ANOVA)分析培养时间内BCAAs对胰腺消化酶参数的影响；试验2利用Duncan法对组均值之间的显著性进行多重比较及交互作用分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 预试验

预试验表明，组织培养时间为60、120和180 min时，α-淀粉酶的总活性随时间增加而增加，但单位时间(每小时)释放的α-淀粉酶活性随时间增加而下降(结果未显示)。因此，选择60 min为培养时间。

2.2 BCAAs浓度对奶牛胰腺消化酶分泌的影响

2.2.1 亮氨酸浓度对胰腺消化酶分泌的影响 不同浓度亮氨酸处理后，奶牛体外胰腺消化酶活性测定结果见表1。从表1可见，随着亮氨酸浓度的升高，胰腺组织中α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性和组织释放α-淀粉酶的活性随亮氨酸浓度提高呈二次曲线变化(P<0.01)，且在5.24 mg/mL时达到最高值。与对照组(0 mg/mL)相比，亮氨酸线性增加了组织释放胰蛋白酶的活性(P<0.05)，但没有增加糜蛋白酶的活性(P>0.05)。

表1 亮氨酸浓度对奶牛体外胰腺消化酶活性的影响Table 1 Effects of Leu concentration on enzyme activity of bovine pancreas in vitro

2.2.2 异亮氨酸浓度对胰腺消化酶分泌的影响 不同浓度异亮氨酸处理后，奶牛体外胰腺消化酶活性测定结果见表2。从表2可见，高浓度异亮氨酸(5.24和10.48 mg/mL)线性增加了组织中糜蛋白酶活性(P<0.05)和组织释放α-淀粉酶的活性(P<0.01)。与对照组相比，异亮氨酸不影响组织中α-淀粉酶和胰蛋白酶分泌，也不影响组织释放胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(P>0.05)。

表2 异亮氨酸浓度对奶牛体外胰腺消化酶活性的影响Table 2 Effects of Ile concentration on enzyme activity of bovine pancreas in vitro

2.2.3 缬氨酸浓度对胰腺消化酶分泌的影响 不同浓度缬氨酸处理后，奶牛体外胰腺消化酶活性测定结果见表3。从表3可见，随着缬氨酸浓度的增加，组织中和组织释放的α-淀粉酶的活性呈二次曲线变化(P=0.05)，且在浓度为5.24 mg/mL时达到最高值；缬氨酸不影响胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(P>0.05)。

表3 缬氨酸浓度对奶牛体外胰腺消化酶活性的影响Table 3 Effects of Val concentration on enzyme activity of bovine pancreas in vitro

2.3 3种BCAAs对奶牛胰腺消化酶分泌的交互影响

不同浓度亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸对奶牛体外胰腺消化酶活性的交互作用见表4。从表4可见，亮氨酸和缬氨酸显著增加了组织中和组织释放α-淀粉酶的活性(P<0.05)，极显著降低了脂肪酶的活性(P<0.01);亮氨酸显著增加了组织中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(P<0.05);异亮氨酸显著增加了组织中糜蛋白酶的活性(P<0.01)，对α-淀粉酶，胰蛋白酶和脂肪酶的活性没有影响(P>0.05);组织释放胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性不受3种BCAAs的影响(P>0.05)，且3种BCAAs之间没有交互作用(P>0.05)。

表4 支链氨基酸对体外胰腺消化酶的交互作用Table 4 Interaction of BCAAs on pancreatic enzyme activity in vitro

3 讨 论

随着奶牛生产性能的增加，更有效地满足奶牛的营养需求是目前面临的巨大挑战。一般在生产中给奶牛供应高淀粉型日粮以满足奶牛的能量需求，但会引起瘤胃酸中毒，并导致过多的淀粉进入小肠。越来越多的研究表明，胰腺消化酶分泌量不足限制小肠中淀粉的消化[4-5]。因此，需要确定营养因子是否影响胰腺消化酶的产生和分泌。增加肉牛小肠酪蛋白供应量可增加动物胰腺重量和胰腺总α-淀粉酶分泌[13，15]。

Swanson等[6,16]发现，增加牛日粮蛋白质含量或真胃灌注酪蛋白中可增加其胰腺α-淀粉酶的活性。蛋白质中某些氨基酸的含量会对胰腺α-淀粉酶分泌产生影响[17-18]。

BCAAs是动物体内无法合成的必需氨基酸，对动物的生长和发育起着重要作用。亮氨酸不仅是哺乳动物的必需氨基酸之一，而且还是蛋白质合成的底物，它作为有效的营养因子，在蛋白质合成和组织代谢中起着重要的调节作用[19]。

BCAAs尤其是亮氨酸可以通过mTOR信号通路在翻译水平影响胰腺消化酶的活性[20]，也可以改变基因的表达，从而在转录水平上调节其活性。当猪口服或注射亮氨酸时，其胰腺、心脏、肝脏和骨骼肌等组织中的蛋白质合成会增加[21-22]。已有研究报道，亮氨酸可通过mTOR信号传导途径刺激奶牛乳蛋白合成[23-25]。

本研究主要的目的是通过体外组织培养的方法，系统研究BCAAs影响荷斯坦奶牛胰腺消化酶分泌的剂量规律，以及3种BCAAs之间是否存在交互作用。

课题组前期研究已经证明，十二指肠灌注亮氨酸可提高山羊胰腺分泌的及小肠食糜的胰蛋白酶、脂肪酶、胰蛋白酶的活性[10,14]。杨昕涧[26]研究表明，牛奶中添加亮氨酸能够提高奶公犊小肠胰腺α-淀粉酶的活性。此外也有报道，添加过量的亮氨酸不再增加α-淀粉酶分泌量[10,14,26]。本试验表明，当培养液中亮氨酸浓度升高时，胰腺α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶分泌量呈先升高、后降低的趋势，当亮氨酸浓度为5.24 mg/mL时，酶分泌量达到最高值。这与前述试验结果一致。

异亮氨酸与亮氨酸结构相似，也是蛋白质合成的底物，生物学功能相近。本试验表明，当培养液中异亮氨酸浓度升高时，胰腺α-淀粉酶和糜蛋白酶分泌量呈先升高、后降低的趋势，当BCAAs浓度为5.24 mg/mL时，酶分泌量达到最高值，异亮氨酸对胰蛋白酶浓度没有影响。Richert等[27]研究表明，增加日粮中异亮氨酸含量会增加泌乳母猪乳汁中的干物质、蛋白质和脂肪含量，并增加幼年建鲤肠、肝、胰腺的消化酶活性[28]。Liu等[29]报道，随着异亮氨酸的小肠灌注量增加，奶牛胰腺α-淀粉酶和胰蛋白酶的活性呈线性增加。异亮氨酸可显著增加奶山羊胰腺组织和培养液中α-淀粉酶的释放速率[30]、胰腺组织糜蛋白酶和胰蛋白酶的总浓度[31]。这与本试验一致。

本试验结果表明，组织释放的α-淀粉酶活性随着缬氨酸浓度呈二次曲线变化，当缬氨酸浓度为5.24 mg/mL时达到最高值，缬氨酸不影响糜蛋白酶和胰蛋白酶释放量。Attaix等[32]研究表明，缬氨酸不影响羔羊体内蛋白质的合成。这与本试验缬氨酸不影响蛋白酶分泌量相符。

目前，三种BCAAs对反刍动物胰腺消化酶分泌的交互影响方面的结果尚未见报道。本研究发现，三种BCAAs对α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的影响均没有交互作用。亮氨酸显著增加了胰腺α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的活性，与前述结果一致。三种BCAAs对脂肪酶活性存在显著的交互作用。亮氨酸显著降低了脂肪酶活性，此方面未见类似报道，有待进一步深入研究。

4 结 论

本研究证实，随培养液中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸浓度提高，体外胰腺组织α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶分泌量呈先升高、后降低的趋势，分别均在5.24 mg/mL时达到最高值。3种BCAAs对α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的分泌量没有交互影响。亮氨酸和缬氨酸降低胰腺组织脂肪酶分泌量，3种BCAAs之间存在交互影响。