银杏叶黄酮的闪式提取工艺优化及抗氧化活性分析

曾思漫，崔 珏

（徐州工程学院 食品与生物工程学院，江苏 徐州 221000）

银杏（Ginkgo biloba L.） 为银杏科银杏属的植物，其叶子主要用来制备药物银杏叶提取物（GBE）。多项研究证明，银杏黄酮是GBE 中重要的活性成分，具有显著的抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、神经保护等作用[1]。目前，采用液相色谱- 质谱联用技术已经从银杏叶中分离鉴定出了110 多种黄酮成分，存在形式主要为游离的黄酮苷元、黄酮苷和双黄酮3 类。其中，黄酮苷元主要包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素、丁香黄素、杨梅素、西伯利亚落叶松黄酮、万寿菊素、芹菜素、木犀草素、黄芩素、柚皮素、圣草酚、染料木素、儿茶素等。而银杏叶中存在的双黄酮主要包括银杏素、异银杏素、双叶甜菜素和香豆黄酮。研究证实这些双黄酮对人体凝血酶活性、胰脂肪酶、脂肪生成也有较强的抑制作用[2]。以上研究结果说明，银杏叶黄酮具有重要的药用价值和经济价值。

试验以银杏叶黄酮得率为指标，通过单因素试验和正交试验设计优化银杏叶黄酮闪式提取的最佳提取工艺，同时对提取的银杏叶黄酮的体外抗氧化活性进行研究，以期为高效提取银杏叶黄酮提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银杏叶，购于安徽亳州中药材交易中心；芦丁标准品、DPPH、ABTS，上海源叶生物科技有限公司提供；亚硝酸钠、无水乙醇、硝酸铝、氢氧化钠等试剂，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

闪式提取仪，河南智晶生物科技有限公司产品；BJ-800A 型粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司产品；DT-1 型电子天平，赛多利斯科学仪器公司产品；UV-2600 型紫外可见分光光度，日本岛津公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 银杏叶黄酮含量的测定和提取率计算

以芦丁为对照品测定银杏叶提取物中的黄酮含量。取银杏叶提取液0.8 mL，依次加入50%乙醇1.9 mL 和5%NaNO2溶液0.15 mL 后混匀，于37 ℃下避光反应6 min，反应后再加入10% Al（NO3）3溶液0.15 mL，继续于37 ℃下避光反应6 min，最后加入1 mol/L NaOH 溶液2.0 mL，于37 ℃下避光反应10 min 后，于波长510 nm 处检测吸光度。

银杏叶黄酮提取率计算公式如下：

1.2.2 闪式提取银杏叶黄酮的单因素试验

（1） 不同体积分数乙醇对银杏叶黄酮提取率的影响。分别取4 g 银杏叶粉，在电压100 V，提取时间40 s，料液比1∶10（g∶mL） 的条件下，分别加入体积分数为50%，60%，70%，80%，90%的乙醇，进行闪式提取银杏叶黄酮。

（2） 不同料液比对银杏叶黄酮提取率的影响。分别取4 g 银杏叶粉，在电压100 V，提取时间40 s的条件下，分别按1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 的料液比加入70%的乙醇，进行闪式提取银杏叶黄酮。

（3） 不同提取时间对银杏叶黄酮提取率的影响。分别取4 g 银杏叶粉，在电压100 V，料液比1∶15的条件下，分别在20，40，60，80，100 s，进行闪式提取银杏叶黄酮。

1.2.3 闪式提取银杏叶黄酮的正交试验

根据单因素试验的结果，采用正交试验设计，以乙醇体积分数、料液比、提取时间为影响因素，以银杏叶黄酮提取率为考查指标，对闪式提取工艺进行优化。

1.2.4 DPPH 自由基清除试验

测定方法参考文献并适当修改[3]。称取20.00 mg DPPH 溶于500 mL 甲醇。将银杏叶黄酮提取液和对照品溶液（1.0 mg/mL） 200 μL，加入3.8 mL DPPH 溶液，于37 ℃下避光反应60 min 后，于波长517 nm 处测吸光度As。测DPPH 溶液与0.2 mL 蒸馏水的吸光度A0，以水溶液为对照品。据下列公式计算样品对DPPH 的抑制率。

1.2.5 ABTS 自由基清除试验

测定方法参考文献并适当修改[4]。将7 mmol/L 的ABTS 溶液5 mL 和140 mmol/L 的过硫酸钾溶液88 μL两者进行混合，在室温条件下进行12 h 的避光反应，制备成的溶液即为ABTS 自由基的储备液。检测时，于波长735 nm 下，用乙醇将储备液稀释为吸光度处于0.7±0.02 的范围的工作液。取25 μL 银杏叶黄酮提取液加入ABTS 自由基的工作液250 μL，迅速振荡35 s 使其混合均匀，于波长735 nm 处测定其吸光度（Ai）。再以同等体积的试剂（A0）、无水乙醇（Aj） 分别作为对照组进行同等条件下的吸光度测定。ABTS 自由基的清除率计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 银杏叶黄酮闪式提取工艺条件单因素试验结果

2.1.1 料液比对银杏叶黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数为70%，提取时间40 s 的条件下，进行料液比对银杏叶黄酮提取率影响的单因素试验。

料液比对银杏叶黄酮提取率的影响见图1。

图1 料液比对银杏叶黄酮提取率的影响

由图1 可知，银杏叶黄酮提取率随着料液比增大而显著增加，但当料液比大于1∶15 之后，提取率增加不明显。因此，1∶15 为最佳料液比。

2.1.2 乙醇体积分数对银杏叶黄酮提取率的影响

在料液比1∶15，提取时间40 s 的条件下，进行乙醇体积分数对银杏叶黄酮提取率影响的单因素试验。

乙醇体积分数对银杏叶黄酮提取率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对银杏叶黄酮提取率的影响

由图2 可知，提取剂乙醇的体积分数较低时，黄酮提取率随乙醇体积分数增加而增大，当乙醇体积分数为70% 时黄酮提取率最高，当乙醇体积分数进一步增加提取率反而下降。因此，确定体积分数为70%的乙醇为最佳提取溶剂。

2.1.3 提取时间对银杏叶黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数70%，料液比1∶15 条件下，进行提取时间对银杏叶黄酮提取率影响的单因素试验。

提取时间对银杏叶黄酮提取率的影响见图3。

图3 提取时间对银杏叶黄酮提取率的影响

由图3 可知，在60 s 内，随着提取时间的延长，提取率也随之增大。当提取时间为40～60 s 时，提取率达最大值。当提取时间继续延长，黄酮提取率略有降低，推测高速剪切产生的热效应可影响黄酮的稳定性。因此，银杏叶黄酮闪式提取的时间应控制在60 s 左右。

2.2 银杏叶闪式提取的正交试验结果

在单因素试验结果的基础上，进行正交试验对银杏叶黄酮的闪式提取工艺进行优化。以乙醇体积分数、料液比、提取时间作为影响因素，进行了三因素三水平的正交试验，各因素水平数分别为乙醇体积分数（A） 分别取60%，70%，80%；料液比（B）为1∶10，1∶15，1∶20；提取时间（C） 分别是40，60，80 s。

闪式提取银杏叶黄酮的正交试验见表1。

表1 闪式提取银杏叶黄酮的正交试验

由极差R 值可知，3 个因素对银杏叶黄酮提取率的影响大小顺序为B>A>C。根据各因素的K 值可知，银杏叶黄酮闪式提取的最佳提取条件为A2B2C1，即乙醇体积分数70%，料液比1∶15，提取时间40 s。分别以正交试验优化所确定的最优提取方案和单因素试验得出的最优提取条件组合，进行3 次验证试验。在正交试验获得的最优方案提取条件下，所得的银杏叶黄酮提取率略高于3 个单因素试验的最优组合方案的黄酮提取率。因此，银杏叶黄酮闪式提取的最优提取工艺为乙醇体积分数70%，料液比1∶15，提取时间40 s。

2.3 银杏叶黄酮清除DPPH 自由基试验结果

银杏叶提取物对DPPH 自由基清除率的影响见图4。

图4 银杏叶提取物对DPPH 自由基清除率的影响

由图4 可知，在0～200 μg/mL 质量浓度内，银杏叶黄酮提取物表现出较好的清除DPPH 自由基的能力，清除能力随着黄酮提取物质量浓度的增大而增强，当其质量浓度达到200 μg/mL 时，DPPH 自由基清除率最大可达80.31%。

2.4 银杏叶黄酮清除ABTS 自由基试验结果

银杏叶提取物对ABTS 自由基清除率的影响见图5。

图5 银杏叶提取物对ABTS 自由基清除率的影响

由图5 可知，在0～200 μg/mL 质量浓度内，银杏叶黄酮提取物表现出较好的清除ABTS 自由基的能力，清除能力随着黄酮提取物质量浓度的增大而增强，当其质量浓度达到200 μg/mL 时，ABTS 自由基清除率最大可达66.46%。

3 结论

通过单因素试验、正交试验优化获得了银杏叶黄酮闪式提取的最优工艺条件，即乙醇体积分数70%，料液比1∶15，提取时间40 s。在此条件下，银杏叶黄酮的提取率为3.99%。该方法制备的银杏叶黄酮具有较好的清除DPPH 和ABTS 自由基的活性。试验结果可为银杏叶黄酮的高效制备提供理论参考依据。