可视化单引物等温扩增技术检测发酵乳制品中沙门氏菌的研究

王妙姝，范春刚，3，郑玮丽，3，王 震，马晓燕

（1. 河北新希望天香乳业有限公司，河北保定 072159；2. 河北农业大学食品科技学院，河北保定 071001；3. 河北省益生功能性乳制品技术创新中心，河北保定 072159）

沙门氏菌是世界上最常见的引发食源性疾病爆发的病原菌[1]。沙门氏菌引起的食物中毒事件位列榜首，具有高检出率、高发病率和高死亡率的特点[2]。2019 年，欧盟发布的食品安全事件统计数据显示，由沙门氏菌污染造成的食物中毒事件占50%以上[3]。营养丰富的发酵乳制品日益受到消费者的青睐，其食用安全性受到人们的高度重视。在乳制品的生产和加工环节中，原料乳极易被沙门氏菌等多种致病菌污染[4-5]。

目前，检测沙门氏菌传统的微生物培养方法存在着耗时长、步骤繁琐等问题[6]。因此，建立一种快速、可靠的检测方法显得尤为迫切和必要。随着分子生物学技术的发展和应用，聚合酶链式反应（PCR） 和环介导等温扩增（LAMP） 等核酸扩增技术以其快速灵敏和特异的优势，逐渐取代传统检测方法，但PCR 技术始终无法摆脱依赖昂贵的热循环仪的局限[7]。LAMP 方法需要4 条或6 条引物，容易造成假阳性结果。

单引物等温扩增技术（Single primer isothermal amplification，SPIA） 是近年来发展的一种新型线性核酸等温扩增技术，具有扩增效率高、忠实性强、有效防污染等优点。试验在SPIA 技术的基础上，结合荧光染料（SYBR Green II） 建立可视化SPIA 检测发酵乳制品中沙门氏菌的方法，可应用于沙门氏菌的风险监测和快速筛选检验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

试验所用菌株见表1。

表1 试验所用菌株

CICC（China Center of Industrial Culture Collection），中国工业微生物菌种保藏管理中心提供；ATCC（America Type Culture Collection），美国模式培养物研究所提供；CMCC（National Center for Medical Culture Collections），中国医学细菌菌种保藏管理中心提供。

1.1.2 样品

购自保定市各大超市及附近市场。

1.1.3 主要培养基和试剂

营养肉汤和营养琼脂，北京陆桥技术股份有限公司提供；Bca DNA 聚合酶及所对应的缓冲液、RNase H 酶及所对应的缓冲液、dNTPs、MgSO4、DEPC 水、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、RNA 酶抑制剂（Recombinant RNase Inhibitor，RRI）、DNA 提取试剂盒、SYBR Green II，大连宝生物工程有限公司提供。

1.1.4 主要仪器

SHZ-82 型恒温水浴锅，常州普天仪器制造有限公司产品；WH-861 型旋涡混合器，太仓市科教器材厂产品；2720 Thermal cycler型PCR 热循环仪，美国Applied biosystems 公司产品；DYY-10C 型电泳仪，北京六一仪器厂产品；BINDA2020D-II 型电泳凝胶成像仪，北京新诚永嘉科技有限公司产品；SW-CJ- 1F/2FD 型超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；BILON-8 型均质器，上海比朗公司产品；DHP420 型电热恒温培养箱，重庆四达实验仪器有限公司产品；BXM-30R 型高压灭菌锅，上海博讯公司产品；ACL110.4 型分析天平，赛多利斯（中国） 有限公司产品；X1 型高速离心机（15 000 r/min），美国Thermo 公司产品；ARA520 型电子天平，美国奥豪斯公司产品；微量移液器（0.50～10.00 μL），德国Eppendorf 公司产品；LG-100B 型鼓风干燥箱，上海实验仪器厂产品；T18 型高速均质机，德国IKA 公司产品；HQ451 型摇床，武汉中科科艺技术发展公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 纯菌的培养

接种冻存管中的鼠伤寒沙门氏菌于营养肉汤中，于37 ℃下过夜培养。之后接种于营养琼脂斜面，37 ℃下培养24 h，挑取单菌落接种于5 mL 的营养肉汤中，37 ℃下振荡培养过夜。

1.2.2 DNA 模板的制备

采用试剂盒法进行DNA 模板的提取。具体步骤参照试剂盒说明书进行，提取好的DNA 模板于-20 ℃下保存备用。

1.2.3 引物设计

选取Genebank 中已经公布的沙门氏菌inv 基因作为靶基因。利用软件Premier 5.0 和DNAMAN 设计SPIA 引物和Blocker。

可视化SPIA 反应的引物见表2。

表2 可视化SPIA 反应的引物

1.2.4 可视化SPIA 反应体系

反应体系共25 μL，包括dNTPs（2.5 μL），2×Bca DNA 聚合酶缓冲液（2.0 μL），5×RNase H 酶缓冲液（2.5 μL），MgSO4（0.9 μL），RRI（0.6 μL），BSA（1.0 μL），Blocker（1.2 μL），DNA/RNA 杂合引物（3.5 μL），模板（1.0 μL），SYBR Green II（0.8 μL，1∶399 稀释），Bca DNA 聚合酶（0.4 μL），RNase H 酶（0.6 μL），RNase-free water 补足体系。

反应条件：94 ℃预变性80 s，然后加入Bca DNA 聚合酶和RNase H 酶，61 ℃下孵育。

1.2.5 可视化SPIA 的特异性验证

采用试剂盒法对菌株进行基因组DNA 提取。阴性对照用无菌蒸馏水代替模板。按照优化好的可视化SPIA 反应体系进行扩增来验证该方法的特异性。

1.2.6 可视化SPIA 检测人工污染发酵乳制品的检出限分析

取25 mL 经国标法检测无沙门氏菌的发酵乳制品加入到225 mL 的无菌生理盐水中，制成匀浆液，用灭菌的生理盐水对匀浆液进行10 倍系列梯度稀释，采用试剂盒法对每个稀释度进行沙门氏菌基因组DNA 的提取，用于检出限的测定。

1.2.7 实际样品检测

为了评估可视化SPIA 方法对乳制品样品中沙门氏菌的检测性能，对235 份发酵乳制品样品进行检测，然后通过国标方法（GB 4789.4—2016） 和可视化SPIA 方法分别对发酵乳制品样品中的沙门氏菌进行检测，根据公式确定可视化SPIA 方法的敏感性、特异性及符合率。具体公式如下：

2 结果与分析

2.1 可视化SPIA 的特异性验证结果

特异性试验结果见表3。

从表3 可看出，用于可视化SPIA 特异性试验的41 株试验菌株中，12 株沙门氏菌检测结果为阳性；其他29 株非沙门氏菌检测结果为阴性。结果表明，所建立的可视化SPIA 方法具有很强的特异性，可用于特异性检测沙门氏菌。

表3 特异性试验结果

2.2 可视化SPIA 检测人工污染发酵乳制品的检出限

SPIA 荧光可视法检出限分析见图1，SPIA 沉淀可视法检出限分析见图2。

图1 SPIA 荧光可视法检出限分析

图2 SPIA 沉淀可视法检出限分析

从图1 可看出，当沙门氏菌纯培养物浓度为3.2×106～3.2×101CFU/mL 时，肉眼观察荧光颜色为黄绿色，判定为阳性结果；当沙门氏菌纯培养物浓度为3.2×100CFU/mL 和3.2×10-1CFU/mL 时，肉眼观察荧光颜色为淡橙色，判定为阴性结果。因此，可视化SPIA 方法检测人工污染发酵乳制品中沙门氏菌的荧光可视法的检出限为3.2×101CFU/mL。

从图2 可看出，当沙门氏菌纯培养物浓度为3.2×106～3.2×102CFU/mL 时，肉眼观察反应管底部出现了白色沉淀，判定为阳性结果；当沙门氏菌纯培养物浓度为3.2×101～3.2×100CFU/mL 时，肉眼观察反应管底部没有出现白色沉淀，判定为阴性结果。因此，可视化SPIA 方法检测人工污染发酵乳制品中沙门氏菌的沉淀可视法的检出限为3.2×102CFU/mL。

2.3 实际样品检测

为了评估可视化SPIA 方法对发酵乳制品样品中沙门氏菌的检测性能，采用GB 4789.4—2016 和可视化SPIA 方法对235 份发酵乳制品样品进行检测，然后根据GB 4789.4—2016 方法对可视化SPIA 方法的检测性能进行评价。根据公式计算可知，可视化SPIA 方法检测发酵乳制品中沙门氏菌的敏感性、特异性和符合率分别为100.00%，98.15%，99.15%。

可视化SPIA 的敏感性、特异性和符合率见表4。

表4 可视化SPIA 的敏感性、特异性和符合率

3 结论

试验建立了一种可视化SPIA 快速检测沙门氏菌的方法。可视化SPIA 方法检测人工污染发酵乳制品中沙门氏菌的荧光可视法和沉淀可视法的检出限分别为3.2×101CFU/mL 和3.2×102CFU/mL。与PCR方法相比，该方法不需要昂贵的PCR 仪，同时避免了繁琐的电泳，在水浴锅或简单的加热模块中即可实现对DNA 的等温扩增。与LAMP 相比，该方法仅需要一条引物，减少了引物相互作用造成的非特异性扩增。总之，研究建立的方法特异性强、操作简便，为沙门氏菌的快速检测提供了新途径，便于在基层检测机构推广应用。