九龙虫对衰老小鼠皮肤的影响

熊慧，戢丹菊，杨家林，刘德洪

（鄂州职业大学医学院，湖北鄂州436099）

随着机体衰老，皮肤生理结构出现功能退化现象，本课题组在前期研究中，提示九龙虫具有抗衰老作用[1]，本实验主要研究九龙虫对D-半乳糖衰老模型小鼠皮肤组织水分、水通道蛋白3、透明质酸、羟脯氨酸、总胶原蛋白、Ⅲ型蛋白的影响。

1 材料与仪器

1.1 动物

清洁级KM 小鼠60 只，体重20±2g，雌雄各半，动物合格证号：42000600015619，许可证号:SCXK(鄂)2015-0018，湖北省实验动物研究中心提供。

1.2 试剂

D-半乳糖，批号：20190523，购自上海喜润化学工业有限公司；九龙虫散，本院自制，用前配成混 悬 液；透 明 质 酸 试 剂 盒 （ELISA），批 号：20200606，购自自上海酶联生物科技有限公司；羟脯氨酸试剂盒（ELISA），批号：20200613，购自自上海酶联生物科技有限公司；皮肤Ⅲ型胶原蛋白试剂盒，批号：20200712，弹性蛋白ELISA 试剂盒，批号：20200723，水通道蛋白3ELISA 试剂盒，批号：202006013，购自南京建成生物工程研究所；维生素E 胶丸，批号：20190724，购自海南养生堂保健品有限公司。

1.3 仪器

渡扬DOR YANG UV759 扫描型紫外可见分光光度计，渡扬精密仪器（上海）有限公司；便携弹性水分油光皮肤测试仪，韩国HUNTKEY 公司；高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；9602A 酶标仪，南京普朗医用设备有限公司。

2 方法

2.1 动物分组与给药

适应性喂养7 天后，将60 只小鼠随机分为6组：分别为九龙虫高、中、低剂量组、维生素E 组、正常组、模型组。造模，九龙虫高、中、低剂量组、维生素E 组和模型组每日注射半乳糖于小鼠颈背皮下，剂量为120mg/kg，一共42 天，致亚急性衰老模型；正常组每日于小鼠颈背皮下注射等量生理盐水。给药，造模1 周后，九龙虫高、中、低剂量组分别给予0.040、0.020、0.010g/kg·d 九龙虫混悬液灌胃，维生素E 组灌胃维生E15mg/kg·d，模型组及正常组给予生理盐水15ml/kg·d 灌胃。最后一次给药24 小时后，处死动物，立即取样，检测各项指标：

2.2 皮肤水分检测

取适量背部皮肤，用皮肤水分测定仪采用干燥法检测皮肤含水量。皮肤含水百分率=（湿质量-干质量）/湿质量×100%

2.3 皮肤组织透明质酸、羟脯氨酸、Ⅲ型胶原蛋白和胶原蛋白检测

取背部皮肤约1g，剪碎，加入9 倍生理盐水，匀浆，2500 r/min 离心10 min，取上清液，按试剂盒说明检测透明质酸、羟脯氨酸、Ⅲ型胶原蛋白和胶原蛋白含量。

2.4 皮肤组织水通道蛋白3 检测

取背部皮肤约1cm2，剪碎，按1:9 比例加入生理盐水，匀浆，2500r/min 离心10min，取上清液1ml，按1∶9 比例用生理盐水再次匀浆，2500r/min 离心5min，按试剂盒说明取上清液检测水通道蛋白3 含量。

2.5 统计学处理

用spss21.0 软件进行实验数据分析，采用均数±标准差（x±S）表示，用T 检验进行显著性检验。

3 结果

3.1 对小鼠皮肤水分、水通道蛋白3 的影响

3 含量明显低于正常组，差异有极显著意义 （P<0.01）；而九龙虫各剂量组和维生素E 组皮肤含水率、水通道蛋白3 明显升高（P<0.05 或P<0.01），与模型组比较，提示九龙虫可以明显改善衰老小鼠皮肤水分和水通道蛋白3 含量。

表1 九龙虫对衰老模型小鼠皮肤水分、水通道蛋白3 的影响(x±S，n=10)

3.2 对小鼠皮肤组织透明质酸、羟脯氨酸的影响

试验结果表明，模型组皮肤组织透明质酸、羟脯氨酸含量明显降低（P<0.01）），与正常组比较；与模型组比较，九龙虫各剂量组和维生素E 组皮肤组织透明质酸、羟脯氨酸明显升高（P <0.05 或P<0.01）。见表2。

表2 九龙虫对衰老模型小鼠皮肤组织透明质酸、羟脯氨酸的影响(x±S，n=10)

3.3 对小鼠皮肤组织Ⅲ型胶原蛋白、胶原蛋白的影响

由表3 可见，与正常组比较，模型组皮肤组织Ⅲ型胶原蛋白、胶原蛋白含量明显降低，差异有极显著意义（P<0.01））；与模型组比较，九龙虫各剂量组和维生素E 组Ⅲ型胶原蛋白、胶原蛋白含量明显升高（P<0.05 或P<0.01），与对小鼠皮肤组织水分、水通道蛋白3、透明质酸、羟脯氨酸的影响基本一致。

表3 九龙虫对衰老模型小鼠皮肤组织Ⅲ型胶原蛋白、胶原蛋白的影响(x±S，n=10)

4 讨论

衰老是一种自然规律，而衰老过程中变化最为显著的器官之一就是皮肤，此过程中，逐渐出现皮肤组织缺水、表皮和真皮层变薄、皮肤胶原蛋白减少、黑色素沉积，从而使皮肤变得松弛、无光泽、并产生皱纹、色斑等现象[2]。随着皮肤衰老，表皮层和真皮层逐渐变薄，皮肤内水分也随之损失，因此，随着年龄的增长，皮肤水分含量会下降[3]，故皮肤含水量可以作为检测皮肤衰老指标之一；皮肤的水转运可影响皮肤含水量，而水转运是通过水通道蛋白来实现的，其中水通道蛋白3 对皮肤水转运影响最大，其可以促进皮肤细胞的水合能力，增加皮肤含水率，从而改善皮肤干燥、萎缩、下垂等表现，作为皮肤水转运的关键蛋白，水通道蛋白3 与皮肤自然衰老密切相关，可作为抗衰老药物的作用靶点[4-5]。本试验显示，九龙虫可明显提高衰老小鼠皮肤含水量和水通道蛋白3 含量，其中九龙虫高剂量组和中剂量组的改善效果优于维生素E 组。

透明质酸是一种大量存在于表皮和真皮的结构成分，属于细胞外基质，是一种非常理想的皮肤保湿剂，因为其可以控制皮肤水分平衡，对皮肤组织有很强的保水作用，从而维持皮肤含水率，延缓皮肤衰老。人体皮肤组织透明质酸的含量是随着年龄的增长逐渐减少的，也是皮肤衰老的表现之一。因此，透明质酸是衡量真皮层保湿能力及皮肤衰老的最佳指标之一[6]。本试验显示，九龙虫可明显提高衰老小鼠皮肤透明质酸含量，结果与上述皮肤含水量和水通道蛋白3 一致。

胶原蛋白是一种结构蛋白，是皮肤的重要组成成分，真皮层衰老主要原因就是胶原蛋白的减少，真皮层在皮肤的中间，大部分由蛋白质构成，这部分蛋白质主要由胶原蛋白和弹性纤维组成，缺少胶原蛋白就会造成真皮层萎缩，皮肤下垂长皱纹，面部衰老。在组成胶原蛋白的所有氨基酸中，其中含量最多、最稳定、最重要的是羟脯氨酸。因此，胶原蛋白和羟脯氨酸含量的高低可以判断出受试动物皮肤衰老的程度[7-8]。本试验显示，九龙虫可明显提高衰老小鼠皮肤羟脯氨酸、胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白含量。

九龙虫可以改善皮肤衰老模型小鼠皮肤皮肤含水量、水通道蛋白3、透明质酸、羟脯氨酸、胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白含量，具有一定的体内抗皮肤衰老作用。