程序性死亡因子4 对“瘀毒”型冠心病及冠状动脉血管病变的诊断价值

胡梦弦，何贵新，袁冬梅，冯雨菲，秦伟彬，王明远，郑国坤，甲子永

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530299；2.广西中医药大学第一附属医院心血管内科二区，广西 南宁 530023）

慢性炎症［1］是动脉粥样硬化斑块形成的主要影响因素，现代微观病理研究发现，慢性炎症类似于中医的瘀毒理论，痰瘀日久不化，阻滞血脉酝酿成毒邪损伤脉络［2］，造成血管内皮细胞损伤、血小板聚集及炎症因子的趋附，最终导致斑块的形成。前期研究［3］发现痰瘀型不稳定性心绞痛患者较其他中医证型斑块更易发生破裂，从而导致急性心肌梗死等不良心血管事件的发生。程序性死亡因子4（programmed cell death factor-4，PDCD4）作为一种肿瘤抑制因子，可通过调控各种炎症因子的表达水平影响斑块的形成。因此，本文通过研究PDCD4 的表达水平与冠状动脉狭窄程度和与中医胸痹“瘀毒”亚型间的关联，为冠心病的治疗提供临床参考依据，同时为中医学对瘀毒型不稳定性心绞痛患者的辩证提供血清学诊断指标。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选 取2019 年9 月～2020 年9 月 广 西 中 医 药大学第一附属医院心血管二区118 例患者，这些患者都被诊断为不稳定性心绞痛且行经皮冠状动脉造影术，其中符合中医辩证分型者80例，不稳定性心绞痛诊断标准符合美国心脏病学 院（ACC）/美 国 心 脏 协 会（AHA）制 订 的acute coronary syndrome（ACS）诊 断 和 治 疗 指南［4］中 关 于 不 稳 定 性 心 绞 痛（unstable angina pectoris，UAP）的相关诊断标准。“痰瘀”型胸痹中医诊断标准以《中药新药临床研究指导原则》［5］中相关内容为诊断标准，症状主要包括：胸部闷痛，以刺痛为主，疼痛部位固定，兼见气短喘促、倦怠、纳呆便溏、口黏、恶心；舌质紫或见瘀斑，苔白腻或白滑，脉细涩或滑。“瘀毒”型以陈可冀制定的因毒致病辩证诊断量化标准［6］为诊断标准，症状主要包括：中重度胸闷痛或刺痛，或伴重度口苦、舌青或青紫、剥苔及舌下脉络紫红或绛紫。中医辩证分析由2 名副高级心血管专科临床主任医师进行，两者诊断意见结果一致则纳入，不一致则由一名正高级心血管专科临床主任医师进行辩证分析。辩证结果为“瘀 毒”组40 例，“痰 瘀”组40 例。本 研 究 获得所有研究对象的知情同意，且通过广西中医药大学第一附属医院伦理委员会审核批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：符合上述西医及中医相关诊断标准。排除标准：心源性休克或急性心功能不全、难治性心力衰竭者；处于妊娠期患者；严重肝肾功能不全（转氨酶大于正常上限2 倍或需要透析治疗）、严重高血压、内分泌系统或血液系统等严重原发性疾病者；存在严重创伤以及肿瘤，近期有重大手术计划；年龄≥85 岁者。

1.3 临床观察指标

收集一般资料有性别、年龄、吸烟、饮酒；临床数据包括白细胞计数（WBC）、中性粒细胞计数（NEUT）、血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）、血清肌酐（SCr）、超敏C 反应蛋白（H-CRP）、D-二聚体、血清尿酸（UA）、胱抑素（Cystatin）、纤维蛋白原（FIB）、总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、载 脂 蛋 白a（APO-a）、载 脂 蛋 白b（APO-b）。

1.4 PDCD4 因子检测

患者入院后采用EDTA 抗凝管采集静脉血标本，6 mL/人，进行2 次离心处理，初次4 ℃，3 000 r/min，10 min，转 移 上 清 至 无RNA 酶 的EP 管；二 次4 ℃，16 000×g，10 min，将 离 心 后的血浆转移至新的无RNA 酶的无菌EP 管中，置于—80 ℃冰箱冷冻保存备用。采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测外周血PDCD4，所用试剂均由杭州赫贝生物科技有限公司提供，酶标仪为美国 SpectraMax 公司生产的 SpectraMax Plus 384 型微孔板分光光度计酶标仪，操作过程严格按照说明书进行。

1.5 冠状动脉狭窄程度及数目

1.5.1 病变数目 冠状动脉直径狭窄所累及主要冠状动脉支数分为：单支病变、双支病变和多支病变，累及左主干时以同时累及左前降支和左回旋支计算。经专业介入医师行经皮冠状动脉造影术检测并评估冠状动脉血管病变支数，结果统计有34 例UA 患者为单支病变，23例为双支病变患者，23 例为三支病变患者。1.5.2 病变程度 以冠状动脉病变近端的动脉内径100% 为计分，轻度病变：狭窄程度为小于50%；中度病变：狭窄程度51%～75%；重度病变：狭窄程度76%～100%。经由专业介入医师行经皮冠状动脉造影术检测并评估冠状动脉血管狭窄程度，结果统计共有UA 患者20 为轻度狭窄，24 例为中度狭窄，36 例为重度狭窄。

1.6 统计学处理

使用SPSS 22.0 统计软件包行统计学分析，连续变量资料以（±s）表示，采用独立样本t检验；分类变量资料以数字和百分比表示，组间采用χ2检验。对于正态分布的数据，采用单因素方差Pearson 直线相关分析，对非正态分布的数据进行Kruskal -Wallis 检验。采用logistic回归模型分析对差异有统计学意义的因素进行分析，进一步筛选出潜在的独立影响因子，建立受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，分析独立影响因子对冠心病“瘀毒”型的诊断价值。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般临床资料分析比较

采用单因素方差分析比较两组受试患者一般资料，两组性别、年龄、吸烟、饮酒、TC、TG、HDL-C、LDL-C、APO-a、APO-b、WBC、NEUT、PLT、MPV 及PDW 差 异 无 统 计 学 意 义（P＞0.05）；两 组D-二 聚 体、H-CRP、SCr、cystatin、UA 及PDCD4 表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05），且 瘀 毒 组 的D-二 聚 体、H-CRP、SCr、cystatin、UA 及PDCD4 表达水平均高于痰瘀组。见表1。

表1 两组间一般资料分析Tab 1 Analysis of baseline information between the two groups

2.2 瘀毒亚型相关性多因素logistic 回归分析

以2.1 结果差异中有统计学意义的因素超敏C 反应蛋白（赋值：连续变量）、胱抑素（赋值：连续变量）、D-二聚体（赋值：连续变量）和PDCD4（赋值：连续变量）为自变量。以中医亚型（赋值：痰瘀型＝0，瘀毒＝1）为因变量，结果显示自变量超敏C 反应蛋白、胱抑素及D-二聚体对冠心病瘀毒亚型的发生无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05）。而PDCD4 对中医亚型-瘀毒型的产生具有显著影响，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 瘀毒亚型相关性多因素logistic 回归分析Tab 2 Multivariate logistic regression analysis of the correlation of stasis toxin subtypes and each index

2.3 ROC 曲线分析PDCD4 对冠心病瘀毒亚型的诊断价值

采用ROC 曲线分析受试患者外周循环血中PDCD4 因子表达水平对冠心病瘀毒型的诊断价值，结果显示PDCD4 诊断瘀毒型AUC 面积 为88.6%，95%CI（1.894，2.532）（P＝0.029），具有一定的预测价值。见图1。

图1 PDCD4 对冠心病瘀毒亚型诊断价值的AUC 曲线面积Fig 1 The AUC curve area of PDCD4 for the diagnostic value of blood stasis and toxin subtypes of coronary heart disease

2.4 PDCD4 因子表达水平与冠状动脉主血管病变支数间联系

比较3 组病变数目患者间外周循环血PDCD4表达水平，3 组间两两比较均存在统计学差异（P＜0.05），且PDCD4 因子表达水平与冠状动脉血管病变支数成正相关（r＝0.468，P＜0.001）。见表3。

2.5 PDCD4 因子表达水平与不同冠状动脉血管狭窄程度间联系

比较3 组狭窄程度患者间外周循环血PDCD4表达水平，3 组间两两比较均存在统计学差异（P＜0.05），且PDCD4 因子表达水平与冠状动脉血管病变程度成正相关（r＝0.535，P＜0.001）。见表3。

表3 PDCD4 因子表达水平与冠脉狭窄程度及病变支数的关联（±s）Tab 3 Correlation between PDCD4 expression level and coronary stenosis degree and the number of diseased branches（±s）

表3 PDCD4 因子表达水平与冠脉狭窄程度及病变支数的关联（±s）Tab 3 Correlation between PDCD4 expression level and coronary stenosis degree and the number of diseased branches（±s）

注：PDCD4：程序性细胞死亡因子4；与单支病变组比较，*P＜0.05;与双支病变组比较，#P＜0.05。与轻度狭窄组相比较，aP＜0.05，与中度狭窄组相比较，bP＜0.05。

血管病变数目n PDCD4 F P 血管狭窄程度n PDCD4 F P单支34 0.685±0.543轻度20 1.567±0.397双支23 2.120±0.543*82.272＜0.001中度24 1.860±1.062a 17.655＜0.01三支23 3.550±0.893*#重度36 3.260±1.088ab

3 讨论

随着社会的发展进步，人们的生活水平逐渐提高，心血管事件的发生率也随之上升［7，8］。因此，积极有效防治心血管疾病对国民的健康非常重要。中医学认为冠心病属于中医“胸痹”范畴，不同历史时期医家对胸痹的病机认识各不相同，但“本虚标实”这一基本病机均被历代中医学家所接受。本虚以正气虚衰，无力鼓动阳气抵抗外邪侵袭，标实则气滞、血瘀、寒凝、痰阻于脉道，导致心脉不通而痛。“痰”、“瘀”作为胸痹中主要的病机，在古代医籍亦有详尽的描述，如清代龚信在《古今医鉴》中指出：“心痹痛者，……素有顽痰死血”，认为痰浊、瘀血是胸痹的主要病理因素。现代医学大家陈可冀院士结合传统医学与冠心病的病理生理特点，认为“胸痹”中的痰、瘀与冠心病中的动脉粥样斑块和血栓相吻合，而瘀毒的出现与动脉血管内膜脂质的沉积、血管壁内皮细胞损伤、炎症因子的趋附及释放和纤维蛋白原溶解降低相关，并进一步提出“因瘀致毒”理论［9，10］。传统医学把“毒”分为内毒与外毒，外毒为外感六淫之邪气，内毒则是由于机体内稳态失调，阴阳失和，导致脏腑功能紊乱，气血运行失常，不能运化气血津液，导致痰浊、水饮、瘀血停滞于体内，日久不化则酝酿成毒。此病理过程与动脉斑块形成过程相似，在冠心病的发展过程中，脂质代谢异常沉积于血管内膜，导致氧化应激异常损伤血管内皮细胞，引起炎症因子的趋附及释放增加。因此，炎症因子在一定程度上可被认为是“内生毒邪”的作用因子。

PDCD4 是一种肿瘤抑制因子，近年来国内外研究表明其通过各种通路调控基因和炎症细胞因子的表达水平在动脉斑块形成过程中发挥着重要作用［11-13］。PDCD4 在转录水平上通过作用于Twist2/cMaf 或ERK/p38 途径抑制巨噬细胞凋亡和IL-10的 产 生［14］，且 其 能 够 被miR-16 和miR-155 靶 向 调节，通过丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB 以及SOCS1-STAT3 信号，抑制巨噬细胞分泌的促炎因子IL-6 的表达，调控动脉粥样硬化的形成［12］。此外，国内研究表明PDCD4 的表达水平与血管狭窄严重程度具有显著的相关性，可作为判断冠状动脉狭窄程度的诊断性生物指标［15］。本研究再次对冠心病患者循环血液中PDCD4 因子进行测定，并结合CAG 检查结果，发现PDCD4 的表达水平确实与冠状动脉血管狭窄程度及病变血管支数成正比，这一结论和陆振涛等［16］学者关于PDCD4 表达水平与冠脉病变关系的研究结果一致。

传统医学以“望、闻、问、切”为手段对疾病进行辩证，但由于缺少实质性相关的检测指标，影响了中医学的发展。本研究初步研究了冠心病“瘀毒”型患者循环血液中的相关炎症因子的表达水平与“瘀毒”亚型的相关性，探讨相关实验数据的影响冠心病瘀毒型的影响因素，发现“瘀毒”组中相关临床炎症指标如白细胞计数、中性粒细胞计数、超敏C 反应蛋白、胱抑素及D-二聚体等较“痰瘀”组数值高，且经SPASS 统计学检验发现超敏C 反应蛋白、胱抑素、D-二聚体和PDCD4 的表达水平的差异在两组间存在统计学意义，可作为“瘀毒”亚型形成的影响因素。本研究还发现超敏C 反应蛋白和D-二聚体在“瘀毒”组中的表达水平明显高于“痰瘀”组，这与张暄尧［17］和王芸素等［18］的研究结论一致，进一步证实相关炎症细胞因子可被认作是“内生毒邪”的物质。且经多因素logistic回归分析发现PDCD4 是影响“瘀毒”亚型形成的独立影响因素，为探索PDCD4 是否能作为“瘀毒”亚型的诊断效能，通过建立ROC 曲线发现PDCD4 诊断“瘀毒”亚型的AUC 曲线面积为88.6%，可在一定程度上作为诊断“瘀毒”亚型的新型诊断标志物。

综上所述，本研究首次探讨PDCD4 的表达水平与冠心病“瘀毒”型辩证和冠状动脉血管病变严重程度的相关性，为中医辩证提供新的科学临床依据，但由于本研究所纳入的样本量较小，且研究所纳入的受试者多为广西地区居民，研究结果具有一定的局限性。研究中团队将进一步开展多地区、多样本的临床实验，从而使本次研究结论更具有代表性。

作者贡献度说明：

胡梦弦、袁冬梅：对文章进行构思与设计并撰写论文；冯雨菲、秦伟彬、甲子永、郑国坤：进行文献和资料的收集、整理；何贵新、王明远：进行文章的可行性分析及论文的修订，对文章整体负责、监督管理。