基于网络药理学及分子对接探讨痛泻要方治疗结直肠癌的作用机制

杨菱霞，丁雯雯，陆 洁，凌 鑫，余 强

（1. 苏州市第九人民医院消化内科，江苏 苏州 215200；2. 苏州市第九人民医院中医科，江苏 苏州 215200；3. 南京医科大学附属苏州医院消化内科，江苏 苏州 215002）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常见的消化系统恶性肿瘤之一［1］，其临床表现主要为便血及排便习惯改变，常伴有腹部隐痛、贫血、便秘或腹泻等情况［2］。上述症状不仅降低患者的生活质量和生存率，还给个人家庭乃至整个社会带来巨大经济负担。CRC 的发病主要与饮食、生活方式、遗传和环境等因素密切相关［3］。流行病学调查结果显示，CRC 的发病率逐年上升且呈现年轻化趋势［4，5］。预计2030 年，全球CRC 患者将增加60%以上［6］。手术切除是CRC 治疗的主要方式，存在较高的复发风险，临床常联合化疗药物和中药复方辅助治疗［7］。研究发现，长期给予CRC 患者服用奥沙利铂、阿司匹林等化疗药物多存在抑郁、焦虑、嗜睡、恶心、呕吐等不良反应［8，9］。中药具有多成分、多途径、多靶点的功能，在降低药物毒性和副作用等方面发挥着独特的优势［10］。

CRC 属 于 中 医“泄 泻”“积 聚”“脏 毒”等 范 畴，《景岳全书》认为凡遇怒气便作泻者多为肝脾不和，肝木克脾土，耗伤脾胃而致病。《灵枢·五变》指出“所愿不遂，肝气郁结，气机不畅，横逆伐脾，脾失健运，而致邪实内积发为积聚”。《外科正宗·脏毒论》提及情志异常易致脾胃受损，运化失司，湿毒内蓄，蓄久化热，而形成肿瘤。故CRC 患者因癌久耗，脾胃虚弱，肝气郁结，情志异常，多属肝郁脾虚之证，其病机本虚标实。痛泻要方首载于《医考方》为治疗肝郁脾虚证的经典名方，方中以白术为君以健脾补虚，白芍为臣以养血柔肝、缓急止痛，陈皮和防风为佐以理气醒脾、升清止泻，四者合用共达调和肝脾、祛湿止泻之效。现代药理研究发现，痛泻要方可通过改善机体炎症及氧化应激反应，抵抗内质网应激诱导的细胞凋亡，下调5-HT 表达水平，纠正肠动力及肠分泌功能异常等方式发挥对消化系统的保护作用［11］。临床观察发现，加味痛泻要方可改善肝郁脾虚型CRC 患者的腹痛、便血、便秘和腹泻交替出现的症状，提升患者的肛门收缩功能［12］。其与化疗药物联合使用可有效降低化疗导致的腹泻、恶心、呕吐等不良反应，提高患者免疫功能，起到减毒增 效 的 作 用［13，14］。但 目 前 痛 泻 要 方 治 疗CRC 的 分子机制和药效物质基础尚未完全阐明，或为其在临床上广泛应用的障碍之一。

网络药理学以高通量的方式从中药复方中筛选出协同增效的化合物，具有“数据量大、分析便捷、结果准确”的特征。其与分子对接技术结合使用可有效地映射到目标化合物及潜在治疗靶点，发挥对药物-疾病-调控机制的预测作用。因此，本文拟通过网络药理学和分子对接的方式挖掘痛泻要方治疗CRC 的靶点和药效物质，为进一步研究作用机制和药物开发提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 活性化合物和靶点的收集

通过TCMSP 数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），检索“白术”、“白芍”、“陈皮”、“防风”四味中药。本研究以药代动力学参数中的口服生物利 用 度（oral bioavailability，OB）及 类 药 性（drug-likeness，DL）为标准，设定OB≥30%，DL≥0.18 以筛选痛泻要方中的活性化合物及预测活性化合物靶点。利用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）将靶点名称统一标准化处理［15］，使用Cytoscape 3.7.2 软件构建“活性化合物-靶点”网络图。

1.2 痛泻要方中活性化合物治疗CRC 作用靶点的收集

通 过MalaCards 数 据 库（https：//www.malacards.org/）以“Colorectal cancer”为关键词检索CRC作用靶点［16］。将痛泻要方中活性化合物相关靶点与CRC 作用靶点互相映射得到交集靶点，使用R 包VennDiagram 绘制痛泻要方-CRC 相关靶点韦恩图［17］。

1.3 生物学功能和通路分析

在DAVID 6.8 数 据 库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）中限定物种为“Homo sapiens”［18］，对痛泻要方治疗CRC 的作用靶点进行基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析［19］。使 用R 包ggplot2 绘 制GO 功 能 的 柱 状 图 和KEGG 通路的气泡图［20］。

1.4 中药-活性化合物-CRC-靶点网络构建

将痛泻要方治疗CRC 的中药、活性化合物、靶点和疾病导入Cytoscape 3.7.2 软件构建“中药-活性化合物-CRC-靶点”网络。使用Network Analysis插件对网络节点进行拓扑参数分析，以Degree 值高低筛选痛泻要方治疗CRC 的核心活性化合物和核心靶点［21］。

1.5 核心靶点的数据库验证

通过THE HUMAN PROTEIN ATLAS 数据库（https：//www.proteinatlas.org）对核心靶点的蛋白表达情况进行验证，分别在PATHOLOGY 和TISSUE 模块中下载CRC 患者和正常人关于核心靶点的无版权结直肠免疫组化图片，并进行比对分析［22，23］。

1.6 核心活性化合物与核心蛋白受体的分子对接分析

从痛泻要方治疗CRC 作用靶点的相互作用网络中选取Degree 值由高到低排序前3 的核心活性化合物和前3 的核心蛋白受体。通过RSCB PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）选取相应靶点蛋白结构 并 下 载 其3D 结 构PDB 格 式 文 件［24］。在Pub-Chem 数 据 库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取核心活性化合物2D 结构的sdf 格式文件，并借助Chem Draw 软件绘其化学结构式［25］。使用Pymol 软件对原PDB 文件进行去除水和原配体处理，Autodock Tolls 软件为靶蛋白受体分子加极性氢，通过Autodock Vina 和Python 脚本实现分子对接［26］。分子对接过程中其结合能越低代表受体与配体的亲和力越好，本研究选取结合能≤－5.0 kJ/mol 的作为化合物与靶点有效结合的筛选依据［27］。

2 结果

2.1 痛泻要方活性化合物和靶点的筛选结果

根据筛选条件从TCMSP 数据库中收集白术活性化合物7 个，白芍活性化合物13 个，陈皮活性化合物5 个，防风活性化合物20 个，映射去重后共获得该方的活性化合物42 个。经Uniprot 数据库对靶点名称进行统一标准化处理后发现痛泻要方中有34 个活性化合物具有对应靶点，共对应114 个靶点。将筛选的活性化合物及靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件构建活性化合物-靶点网络图。图中圆形表示靶点，V 形表示活性化合物，共包括148 个节点（114 个靶点和34 个化合物）和356 条边。见图1。

图1 活性化合物-靶点网络图Fig 1 The network of diagram of active compounds-targets

2.2 痛泻要方中活性化合物治疗CRC 作用靶点交集结果

在MalaCards 数据库中检索到838 个CRC 相关的潜在靶点，将其与痛泻要方对应的114 个靶点互相映射后得到52 个交集靶点，见图2。

图2 痛泻要方-CRC 相关靶点韦恩图Fig 2 Venn diagram of Tongxie Yaofang-CRC related targets

2.3 生物学功能和通路分析

GO 功能分析结果显示，52 个交集靶点预测到1 410 个富集结果（P＜0.05）。其中包括生物过程（BP）1 256 个，主要富集于脂质代谢、激素反应、癌细胞增殖和凋亡等过程；细胞组成（CC）34 个，主要影响CRC 细胞线粒体膜电位、内质网应激；分子功能（MF）120 个，主要涉及氧化还原酶活性、蛋白激酶活性等，本研究分别依据P值大小筛选排名前20 位的BP、CC、MF 结果绘制柱状图，见图3。

图3 痛泻要方治疗CRC 的GO 功能柱状图Fig 3 GO function histogram of the key targets of Tongxie Yaofang in treatment of CRC

KEGG 分析结果显示，52 个交集靶点共参与104 条信号通路过程（P＜0.05），主要涵盖磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、Toll 样受体（TLR）信号通路等，本研究依据P值大小筛选排名前20 位的信号通路绘制通路气泡图，见图4。

图4 痛泻要方治疗CRC 的KEGG 通路气泡图Fig 4 KEGG pathway enrichment bubble chart of the key targets of Tongxie Yaofang in treatment of CRC

2.4 痛泻要方中活性化合物治疗CRC 作用靶点的筛选结果

将痛泻要方治疗CRC 的中药、活性化合物、靶点和疾病导入Cytoscape 3.7.2 软件构建中药-活性化合物-CRC-靶点网络图，见图5。图中三角形表示中药，V 形表示中药相应的活性化合物，圆形和绿色表示活性化合物对应的靶点，菱形和天蓝色表示CRC，紫色表示白术和其相应的活性化合物，粉色表示白芍和其相应的活性化合物，橙色表示陈皮和其相应的活性化合物，浅紫色表示防风和其相应的活性化合物，棕色表示白芍和防风共同的活性化合物。网络图中共包括85 个节点（52 个靶点、28 个活性化合物、4 个中药和1 个疾病）和248 条边。其中，28 个活性化合物是通过痛泻要方的活性化合物靶点与52个交集靶点映射筛选而来。通过Network Analysis插件对网络图分析发现，由Degree 值从高到低排序前3 名的核心活性化合物分别为MOL000173-汉黄芩素（wogonin）、MOL000422-山奈酚（kaempferol）、MOL000358-β-谷甾醇（beta-sitosterol），前3 名的核心靶点为PTGS2、PTGS1、ESR1。上述化合物和靶点与痛泻要方治疗CRC 的关联性最强，见表1、2。

图5 中药-活性成化合物-CRC-靶点网络图Fig 5 The network of diagram of herbs-active compounds-targets

表1 中药-活性化合物-CRC-靶点网络中Degree 值较高的核心靶点Tab 1 The key targets with high Degree values in the network of herbs-active compounds-CRC

2.5 核心靶点的数据库验证结果

免疫组化结果显示，CRC 组织中PTGS2、PTGS1、ESR1 呈现较强的阳性蛋白表达且主要集中在CRC 细胞的细胞质与细胞膜内，正常肠组织中PTGS2、PTGS1、ESR1 呈现较弱的阳性蛋白表达。

表2 中药-活性化合物-CRC-靶点网络中Degree 值较高的核心化合物Tab 2 The active compounds with high Degree values in the network of herbs-active compounds-CRC

2.6 核心活性化合物与核心靶点蛋白受体的分子对接结果

利用AutoDock Vina 软件和Python 脚本，对中药-活性化合物-CRC-靶点网络中degree 值最高的3 个核心化合物（汉黄芩素、山奈酚、β-谷甾 醇）和3 个 核 心 靶 点 蛋 白（PTGS2、PTGS1、ESR1）进 行 分 子 对 接，其 中PTGS2、PTGS1、ESR1 靶 点 蛋 白 的PDB ID 分 别 为1pxx、1prh、1uom，活性化合物和靶点蛋白受体间的结合活性度越高，则两者结合能越低。结果表明，3 个核心活性化合物与3 个核心靶点蛋白受体对接结果均小于≤－5.0 kJ/mol，其中汉黄芩素与PTGS2、PTGS1、ESR1 的 结 合 能 分 别 为－36.00、－30.98、－36.42 kJ/mol；山奈酚与PTGS2、PTGS1、ESR1 的结合能分别为－27.21、－27.21、－33.91 kJ/mol；β-谷 甾 醇 与PTGS2、PTGS1、ESR1的结合能分别为－23.02、－23.02、－33.91 kJ/mol；提示痛泻要方核心活性化合物和CRC 核心靶点之间具有良好的结合能力。具体组合情况，见表3，图8～10。

表3 核心化合物与核心靶点结合能Tab 3 Binding energies of key active compounds with core targets

图8 Wogonin 与PTGS2、PTGS1、ESR1 分子对接图（左为整体，右为细节）Fig 8 The molecular docking diagram of wogonin and PTGS2，PTGS1，ESR1（left：overall，right：detail）

图9 Kaempferol 与PTGS2、PTGS1、ESR1 分子对接图（左为整体，右为细节）Fig 9 The molecular docking diagram of Kaempferol and PTGS2，PTGS1，ESR1（left：overall，right：detail）

图10 beta-Sitosterol 与PTGS2、PTGS1、ESR1 分子对接图（左为整体，右为细节）Fig 10 The molecular docking diagram of beta-Sitosterol and PTGS2，PTGS1，ESR1（left：overall，right：detail）

3 讨论

CRC 是常见的消化系统恶性肿瘤，可严重影响患者的生活质量。痛泻要方在治疗CRC 方面具有减毒增效的作用，但其具体分子机制和药效物质尚未完全阐明。目前，网络药理学和分子对接技术已开始规模化应用于中药活性化合物筛选及关键靶点对接等领域，为初步探寻痛泻要方治疗CRC 的作用规律提供了可能。本研究通过网络药理学获取了痛泻要方治疗CRC 的28 个活性化合物和52 个靶点，并借助GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析、构建中药-活性化合物-CRC-靶点网络及关键靶点验证等方式，从整体上展示了二者间的分子作用关系及涵盖的信号通路情况。

GO 功能富集分析提示，痛泻要方干预CRC 可能与加速机体脂质代谢、激素反应、癌细胞增殖和凋亡、线粒体膜电位、内质网应激、氧化还原酶活性和蛋白激酶活性等条目密切相关。其中，CRC 的发病与患者机体内脂质代谢异常存在高度关联性，脂肪细胞可通过分泌激素、促炎因子等介质，加速CRC 细胞的增殖和转移速率［28］。激活蛋白酶活性能够有效降低CRC 细胞（HCT116 和HCT8）的活性氧含量、线粒体膜电位和内质网应激反应，进而导致癌细胞凋亡［29］。

KEGG 通路富集提示，痛泻要方干预CRC 可能与PI3K/AKT 信号通路、TNF 信号通路、TLR 信号通路密切相关。其中，大多数CRC 患者发病过程中伴有PI3K/AKT 信号通路异常且PI3K/Akt 信号抑制剂被认为是有效的CRC 治疗剂［30］。PI3K/AKT信号通路能够调控关键miRNA 的转录表达，增强对CRC 细胞增殖、迁移的抵抗功能［31］。TNF 家族成员可影响CRC 患者的疾病发展进程和预后情况［32］。CRC 临床常用化疗药物5-氟尿嘧啶能够通过抑制TNF 信号通路，达到降低结肠癌干细胞的增殖和转移能力的目的［33］。TLR 信号传导在激活固有免疫和适应性免疫从而调节机体炎症反应中起关键性作用，其信号传导失调可诱导CRC 患者产生IL-1β、TNFα、IL-6 等炎症因子，导致上皮层止血功能紊乱，进而加快CRC 的进程［34］。调控TLR2 可有效抑制CRC 细胞增殖和上皮间质转化，进一步降低癌细胞的迁移和侵袭能力［35］。

中药-活性化合物-CRC-靶点网络分析发现，痛泻要方治疗CRC 的主要活性化合物属汉黄芩素、山奈酚、β-谷甾醇等，主要作用靶点为PTGS2、PTGS1、ESR1 等。其中，汉黄芩素为一种类黄酮化合物，具有广泛的生物学作用，可显著抑制人结肠癌细胞（HCT-116）的增殖效率，促使DNA 片段化及染色质浓缩［36］。山奈酚同属一种常见的类黄酮化合物，大量存在于蔬菜和水果中，常被用于癌症的化疗过程中［37］。其可通过调控PI3K/Akt 信号通路，使癌细胞周期停滞在G2 /M 期来实现防治CRC的作用［38］。β-谷甾醇作为一种植物甾醇，可发挥抑制炎症及氧化应激反应，诱导细胞凋亡等作用［39］。β-谷甾醇常用作CRC 患者化疗期间的辅助药物，其主要通过抑制MDM2-p53 信号通路，进而提高抗癌药物OXA 的疗效及降低其不良反应的发生率［40］。前列腺素内过氧化物合酶（PTGS）又称环氧合酶（COX），其包括诱导型PTGS2（COX-2）和组成型PTGS1（COX-1）。HCT116 和HT29 经COX-1 基因沉默后可诱导细胞内线粒体膜电位去极化，抑制三磷酸腺苷的产生，增加活性氧的含量，导致癌细胞 凋 亡［41］。通 过 分 析CRC 组 织 标 本 提 示，超 过80%的CRC 组织中呈现COX-2 中、高度阳性表达，主要存在染色质状态的异质性［42］。人体肠道内ESR1 单核苷酸多态性与CRC 的易感性和疾病严重程度存在密切关联［43］。ESR1 在CRC 组织中的表达水平显著高于正常的结直肠组织［44］，给予CRC 患者5-FU 治疗后可显著降低患者癌组织中ESR1 mRNA 的表达水平及无病生存期［45］。

此外，上述结果在THE HUMAN PROTEIN ATLAS 数据库及药物-靶点分子对接中得以验证。其中，免疫组化结果提示CRC 组织与正常肠组织相比PTGS2、PTGS1、ESR1 呈现较强的阳性蛋白表达；分子对接结果提示痛泻要方中3 个核心活性化合物与PTGS2、PTGS1、ESR1 结合后均展现出了良好的亲和力。

综上所述，本研究运用网络药理学、分子对接等手段，从直观的角度对痛泻要方治疗CRC 进行了整体的认识，为进一步深入研痛泻药方干预CRC 提供了重要参考，相比于传统药理学研究呈现出了一定的优势。受限于本研究仅单纯的考虑到中药、活性化合物、靶点三者之间的数量关系，尚未兼顾到活性化合物与靶点产生的药效强度因素，因此药物在体内的作用机制还需要通过进一步实验验证。