活血灵方对大鼠下肢深静脉血栓形成及Notch2/Hes－1表达的影响

侯彦杰，李小玲，刘园园，马亮英，*

（1.新疆医科大学第二附属医院，新疆 乌鲁木齐 830063；2.新疆医科大学第七附属医院，新疆 乌鲁木齐 830028）

深静脉血栓形成（Deep venous thrombosis，DVT）是指血液在深静脉中非正常凝结，造成下肢静脉回流障碍，血流缓慢、静脉壁受损、高凝状态为引发静脉血栓的主要因素［1-2］，常有下肢肿胀、疼痛等表现，若不及时治疗，血栓将会扩散至肢体深静脉主干，严重影响患者生命安全［3］。中医学认为DVT 属于“股肿”范畴，是骨断、筋断导致血行不畅、瘀血阻滞、损伤血脉，活血灵方具有消肿止痛、活血化瘀等功效，能有效缓解髋关节术后患者DVT，并改善其凝血功能［4］，但其具体作用机制仍不清晰。多项研究表明DVT 与炎症反应密切相关，机体受到损伤后引起炎症因子聚集，加速机体高凝状态，引发血小板聚集、内皮损伤等不良后果，最终造成血栓形成［5］。资料显示氧化应激反应与肺动脉内皮功能障碍密切相关，并参与肺栓塞形成［6-7］。Notch2 是Notch蛋白分子家族成员，通过激活Hes－1进行细胞间信息的传递，与机体氧化应激反应及炎症反应均有一定关联［8-9］。但是关于深静脉血栓、活血灵方与Notch1/Hes－1 信号通路之间的研究较少，本文通过建立下肢DVT大鼠模型，探究活血灵方对大鼠炎症、氧化应激反应及Notch1/Hes－1信号通路的影响。

1 材料

1.1 动物

50 只健康1 个月龄SPF 级SD 雄性大鼠，体质量（260 ± 40）g，实验动物许可证号：SCXK（粤）2016－0002，由广东省医学实验动物中心提供。所有大鼠在本院动物房内饲养，保持自然光照及通风，自由饮食、饮水，温度25 ℃，相对湿度50%，每周清洁1次鼠笼。

1.2 主要试剂及仪器

活血灵组方：红花、当归、赤芍、柴胡、生地黄、续断、羌活、牛膝、威灵仙和甘草（采购于仲景大药房）；HE 染色试剂盒（产品编号：WH2144，上海威奥生物科技有限公司）；白细胞介素－6（interleukin－6，IL－6）、白细胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）、肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA 试剂盒（货号：ml102828、ml037361、ml002859、ml077384、ml097316、ml077379，上海酶联生物科技有限公司）；蛋白质提取试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（货号：R0010、PC0020，北京索莱宝科技有限公司）；Notch2、Hes－1、三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔源一抗、羊抗兔IgG（货号：ab137665、ab108937、ab8245、ab6728，Abcam）；C2000－4 全自动血凝仪（济南来宝医疗器械有限公司）；F280SZ 全自动血液流变学仪（重庆迈迪克公司）；SMZ745 光学显微镜（日本尼康公司）；MR－96A 全自动酶标仪（南京贝登医疗股份有限公司）。

2 方法

2.1 动物模型制备及分组给药

50 只大鼠按照随机数字表分为对照组、模型组和活血灵方低剂量组（6.3 g/kg）、中剂量组（12.6 g/kg）、高剂量组（25.2 g/kg），每组10 只。参考文献［10］制备下肢DVT 大鼠模型并稍做修改，造模前大鼠禁食禁水8 h，将大鼠麻醉后仰卧位固定，将大鼠左侧腹股沟内侧脱毛后消毒，纵向作约1.5 cm 的伤口，暴露股静脉血管后用4－0 丝线结扎相邻3 处股静脉，然后缝合伤口，用髋人字形石膏固定大鼠大腿，对照组仅行纵向切口。采用肉眼直接观察法验证模型构建是否成功，如观察到大鼠双足明显肿胀、下肢皮肤颜色青紫，提示血栓形成；造模后24 h 可拆开皮肤缝线进一步验证血栓形成情况，观察到股静脉管腔变粗、呈紫黑色，其中有深色物质存在即表明下肢DVT 大鼠模型构建成功。模型构建成功后开始给药。

活血灵方药物制备：红花、当归、赤芍各15 g，柴胡、生地黄、续断、羌活、牛膝、威灵仙各12 g，甘草6 g，按照料液比为1 g∶10 mL 加入蒸馏水，浸泡药材2 h 后开始加热，煮沸30 min，过滤，药渣继续加入适量蒸馏水加热煮沸0.5 h，合并2 次滤液，浓缩至含生药量为2.52 g/mL 备用。参考文献［11］设置活血灵方给药剂量，按照各组给药剂量进行灌胃处理，持续灌胃14 d，模型组及对照组灌胃等量蒸馏水。

2.2 大鼠血液及血栓静脉组织标本采集

给药结束后24 h，将大鼠麻醉，静脉取血3 mL，测定各组大鼠凝血相关指标。腹主动脉取血，用于血液流变学指标检测。获取大鼠血栓形成处静脉组织，2 只用于病理形态学观察，8 只用于炎症、氧化应激因子及Notch2/Hes－1通路相关蛋白检测。

2.3 大鼠凝血相关指标及血液流变学指标检测

各组小鼠的D－二聚体水平（D－dimer）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）均用全自动血凝仪测定。全自动流变学仪中测定血浆黏度、纤维蛋白、红细胞压积。

2.4 大鼠血栓形成处静脉组织形态学观察

取“2.2”项中各组大鼠血栓形成处静脉组织，修整后在4%多聚甲醛中固定，经脱水、透明、石蜡包埋后切成厚度约为4 μm的常规病理切片，按照HE染色试剂盒的要求进行染色，封片后于显微镜下拍照并观察。

2.5 大鼠血栓形成处静脉组织炎症因子指标及氧化应激指标检测

取“2.2”项中各组大鼠血栓形成处静脉组织，研磨成组织匀浆，离心后取上清液，按照IL－1β、IL－6、TNF－α、MDA、SOD、GSH－Px 相关试剂盒中的具体操作步骤进行测定。

2.6 大鼠血栓形成处静脉组织Notch2/Hes－1通路相关蛋白检测

取“2.2”项中各组大鼠血栓形成处静脉组织，用蛋白质提取试剂盒提取其中蛋白质，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定其中蛋白质浓度，将各组待测样品加热变性后各取20 μL，SDS－PAGE 电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转移到硝酸纤维膜上，经吐温－20－三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液（Tris－buffered saline with Tween－20，TBST）漂洗后置于5%的脱脂奶粉溶液中室温封闭2 h，加入Notch2（1∶300）、Hes－1（1∶300）、GAPDH（1∶1 000）兔抗鼠一抗，4 ℃冰箱中孵育过夜后用TBST漂洗3次，加入羊抗兔IgG（1∶1 000）并室温孵育2 h，经TBST漂洗、显色、曝光后观察结果并拍照。

2.7 统计学处理

本实验所得数据均用SPSS 22.0 软件统计分析，计量资料以±s表示，单因素方差分析用组间比较，进一步两组间比较用LSD－t检验分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 动物基本情况观察

对照组大鼠生长状况良好，伤口愈合较快；模型组大鼠活动减少，双足明显肿胀、下肢皮肤颜色青紫，拆开皮肤缝线可观察到股静脉管腔变粗、呈紫黑色，其中有深色物质存在；活血灵方各剂量组大鼠上述情况均得到一定的改善。

3.2 各组大鼠血栓形成处静脉组织形态学观察

对照组大鼠血管形态正常；模型组大鼠血管内存在血栓，血管壁呈炎性浸润；与模型组相比，活血灵方各剂量组血管血栓量显著减少，血管壁浸润均得到一定的改善，并具有一定的剂量－效应关系，其中高剂量组改善效果较好。见图1。

图1 各组大鼠血栓形成处静脉组织形态学比较（HE染色，×200）

3.3 活血灵方对各组大鼠血液凝血指标及血液流变指标的影响

与对照组相比，模型组大鼠D－dimer、血浆黏度、纤维蛋白、红细胞压积显著升高（P＜0.05），APTT、TT显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，活血灵方各剂量组大鼠D－dimer、血浆黏度、纤维蛋白、红细胞压积显著降低（P＜0.05），APTT、TT 显著升高（P＜0.05），且具有一定的剂量效应关系。见表1。

表1 各组大鼠血液凝血指标比较（±s，n=10）

表1 各组大鼠血液凝血指标比较（±s，n=10）

注：与对照组相比，*P ＜0.05；与模型组相比，#P ＜0.05；与活血灵方低剂量组相比，△P ＜0.05；与活血灵方中剂量组相比，◇P ＜0.05。

组别对照组模型组活血灵方低剂量组活血灵方中剂量组活血灵方高剂量组红细胞压积（%）37.29±1.27 45.01±1.30*42.87±1.52*#40.94±1.30*#△39.05±1.31*#△◇D－dimer（μg/L）38.20±8.06 108.47±10.08*92.56±9.92*#75.91±9.81*#△59.24±9.77*#△◇APTT（s）39.64±6.17 17.95±1.89*22.16±2.68*#29.07±4.48*#△36.81±5.15*#△◇TT（s）19.06±1.83 9.89±0.85*11.68±0.91*#14.93±1.26*#△17.08±1.67*#△◇血浆黏度（μm）1.22±0.05 1.89±0.08*1.71±0.04*#1.55±0.04*#△1.34±0.05*#△◇纤维蛋白4.01±0.23 5.93±0.25*5.50±0.26*#4.94±0.27*#△4.35±0.18*#△◇

3.4 活血灵方对各组大鼠血栓形成处静脉组织炎症因子表达水平的影响

与对照组相比，模型组大鼠血栓形成处静脉组织中IL－1β、IL－6、TNF－α 表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，活血灵方各剂量组血栓形成处静脉组织中IL－1β、IL－6、TNF－α 表达水平均显著降低（P＜0.05），且具有一定的剂量效应关系。见表2。

表2 各组大鼠血栓静脉组织炎症因子指标比较（±s，n=8）

表2 各组大鼠血栓静脉组织炎症因子指标比较（±s，n=8）

注：与对照组相比，*P ＜0.05；与模型组相比，#P ＜0.05；与活血灵方低剂量组相比，△P ＜0.05；与活血灵方中剂量组相比，◇P ＜0.05。

TNF－α（pg/mL）135.82±12.36 382.93±16.28*321.83±15.38*#257.29±14.16*#△186.97±13.61*#△◇组别对照组模型组活血灵方低剂量组活血灵方中剂量组活血灵方高剂量组IL－1β（pg/mL）193.61±12.38 394.33±17.21*345.01±16.05*#298.72±15.78*#△232.66±13.06*#△◇IL－6（pg/mL）103.47±10.26 213.46±17.75*186.39±16.05*#161.59±14.39*#△133.77±11.28*#△◇

3.5 活血灵方对各组大鼠血栓形成处静脉组织氧化应激指标的影响

与对照组相比，模型组大鼠血栓形成处静脉组织中MDA 表达水平显著升高（P＜0.05），SOD、GSHPx 表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，活血灵方各剂量组大鼠血栓形成处静脉组织中MDA 表达水平显著降低（P＜0.05），SOD、GSH－Px 表达水平显著升高（P＜0.05），呈现出一定的剂量效应关系。见表3。

表3 各组大鼠血栓静脉组织氧化应激指标比较（±s，n=8）

表3 各组大鼠血栓静脉组织氧化应激指标比较（±s，n=8）

注：与对照组相比，*P ＜0.05；与模型组相比，#P ＜0.05；与活血灵方低剂量组相比，△P ＜0.05；与活血灵方中剂量组相比，◇P ＜0.05。

GSH－Px（U/mg）257.31±12.58 194.71±9.46*208.26±10.17*#224.91±11.51*#△240.38±11.63*#△◇组别对照组模型组活血灵方低剂量组活血灵方中剂量组活血灵方高剂量组MDA（nmol/mg）5.97±1.01 17.03±1.85*14.82±1.47*#11.37±1.59*#△8.01±1.33*#△◇SOD（U/mg）125.46±8.19 85.95±4.23*96.83±6.81*#104.74±7.56*#△116.39±8.09*#△◇

3.6 活血灵方对各组大鼠血栓形成处静脉组织Notch2/Hes－1 通路相关蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组大鼠血栓形成处静脉组织Notch2、Hes－1蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，活血灵方各剂量组大鼠血栓形成处静脉组织Notch2、Hes－1蛋白表达显著降低（P＜0.05），具有一定的剂量效应关系。见表4和图2。

图2 各组大鼠血栓静脉组织Notch2/Hes－1通路相关蛋白表达

表4 各组大鼠血栓静脉组织Notch2/Hes－1通路相关蛋白表达比较（±s，n=8）

表4 各组大鼠血栓静脉组织Notch2/Hes－1通路相关蛋白表达比较（±s，n=8）

注：与对照组相比，*P ＜0.05；与模型组相比，#P ＜0.05；与活血灵方低剂量组相比，△P ＜0.05；与活血灵方中剂量组相比，◇P ＜0.05。

Hes－1/GAPDH 0.91±0.15 2.05±0.29*1.76±0.23*#1.49±0.20*#△1.23±0.18*#△◇组别对照组模型组活血灵方低剂量组活血灵方中剂量组活血灵方高剂量组Notch2/GAPDH 0.85±0.11 1.98±0.25*1.68±0.23*#1.43±0.19*#△1.15±0.17*#△◇

4 讨论

DVT 为髋关节置换等骨科手术术后常见并发症［12］，以下肢深静脉血栓为主，常伴有肢体疼痛、肿胀等表现［13］。资料显示静脉结扎法构建深DVT 动物模型可完全阻塞血流，导致静脉内皮细胞受损，血流瘀滞，所建立的模型稳定、可靠［14］。本研究结果显示，与对照组相比，模型组大鼠活动减少，双足明显肿胀、下肢皮肤颜色青紫，拆开皮肤缝线可观察到股静脉管腔变粗、呈紫黑色、其中有深色物质存在，血管壁受损严重，表明下肢DVT 大鼠模型构建成功。活血灵方主要由红花、当归、赤芍等药物组成，具有活血化瘀、消肿止痛、降低血液黏稠度、增加血流量等功效，可有效防治深静脉血栓形成［15］。本研究结果显示，经过活血灵方治疗的模型大鼠血管壁受损、血栓形成、下肢肿胀等不良症状均得到缓解，提示活血灵方可显著缓解下肢DVT大鼠的病情，但其具体机制仍不清晰。

血栓形成机制复杂，机体高凝状态、高黏血症等因素与深静脉血栓的形成密切相关，APTT、TT、D－dimer是凝血功能重要指标，APTT、TT缩短、D－dimer升高提示患者纤溶活性异常、血液存在高凝状态，有利于血栓形成［16］。血栓形成与机体炎症反应联系密切，BITTAR等［17］研究发现DVT 患者血清IL－6 等炎症因子水平显著升高，是血栓形成的危险因素，血管发生损害后，炎症因子迅速集中，血管损伤部位受到炎性浸润，导致血管内皮功能障碍并加速机体高凝状态，进而促进血栓形成［18］。EKIM 等［19］研究结果显示，DVT 患者机体氧化应激反应显著增加，提示氧化应激反应也参与了血栓形成。机体抗氧化能力不足、自由基增多等均可引起机体的氧化应激反应，在正常生理条件下，抗氧化物质通过SOD、GSH－Px、CAT 等自由基清除酶对机体的氧化应激起保护作用，从而减轻血管内皮损伤，维持血管舒张功能，降低血栓形成几率［19-20］。本研究结果显示，与对照组相比，模型组大鼠血浆D－dimer、血浆黏度、纤维蛋白、红细胞压积水平显著升高，APTT、TT值显著缩短，血栓形成处静脉组织中IL－1β、IL－6、TNF－α、MDA 水平显著升高，SOD、GSH－Px 水平显著降低，提示DVT 大鼠机体存在凝血功能异常、血流受阻、炎症反应及氧化应激反应，经过活血灵方治疗后，大鼠的凝血功能逐渐恢复正常，血浆黏度逐渐降低，炎症反应及氧化应激反应均得到缓解，表明活血灵方可通过减轻炎症反应，提高机体抗氧化能力发挥缓解血栓形成的作用。

Notch信号通路广泛存在于机体多种组织中，具有4种受体，Notch2是其中之一，资料显示Notch2/Hes－1通路与机体炎性反应密切相关，机体缺血等因素均可激活Notch2/Hes－1 通路，Notch2 蛋白与Hes－1 结合可引起下游炎症控制基因的激活，促使机体IL－1β、TNF－α 等炎症因子的大量释放，最终导致机体损伤［21-22］；王宁等［23］研究表明，上调Notch 通路可加重机体氧化应激损伤，抑制Notch 信号通路可保护细胞免受氧化应激损伤。本研究结果显示，与模型组比较，经过活血灵方治疗的大鼠血栓形成处静脉组织Notch2、Hes－1 蛋白表达显著降低，提示活血灵方可能通过抑制Notch2/Hes－1 通路降低DVT 大鼠炎症反应及氧化应激反应，进而发挥其缓解DVT的作用。

综上所述，活血灵方可能通过抑制Notch2/Hes－1通路缓解DVT 大鼠病情，但其所含药物种类较多，作用机制复杂，但本研究并未进行相关通路抑制剂对比实验，因此仍需深入研究。