龟甲胶对环磷酰胺引起的贫血大鼠的改善作用研究

胡海林，肖丹，2，王磊，何清湖，唐宇，*

（1.湖南中医药大学 湖南 长沙 410208；2.长沙市中医医院 湖南 长沙 410004；3.衡阳东健药业有限公司 湖南 衡阳 421431；4.湖南医药学院 湖南 怀化 418000）

贫血是指单位容积循环血液中红细胞、血红蛋白含量低于正常参考值下限引起的一系列临床综合征。调查显示，贫血影响着世界1/4 的人口，中国居民贫血的平均患病率为20.1%［1－2］。贫血发病缓慢，没有特异性的临床表现，是造成成年人生产力降低与青少年生长发育异常的重要原因之一［3－4］。贫血在中医学中多归属于“血虚”“虚劳”的范畴，多因先天不足、脾胃虚弱、后天失养等导致气血生化不足，进而引发一系列脏腑失养的虚弱病症［5］。

龟甲胶是由乌龟腹甲经煎煮、浓缩后制成的固体胶，其味咸、甘，性微寒，归肝、肾、心经，具有滋阴潜阳、补血止血、益肾健骨的功效，被《神农本草经》列为上品。本研究拟通过观察龟甲胶对贫血大鼠模型的作用，研究龟甲胶改善贫血的效果与作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠72 只，雌雄各半，5～6 周龄，体质量180～220 g，采购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2019－0004，动物质量合格证号：430727201101698051。分笼饲养于湖南中医药大学SPF 级动物房，实验单位许可证编号：SYXK（湘）2019－0009。自由饮水摄食，饲养实验室温度18～26 ℃，湿度55%左右，每日常规饲料喂养。

1.2 主要药物及试剂

龟甲胶（湖南东健药业有限公司，批号：20200901）；注射用环磷酰胺（德国安道生，批号：0E387A）；利可君片（江苏吉贝尔药业股份有限公司，批号：20030303）；EPO试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：B18031506）；GM－CSF 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：B19031507）；苏木素、伊红（Wellbio公司）。

1.3 主要设备

兽用全自动血液细胞分析仪（迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：BC－2800vet）；台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，货号：H1650R）；全自动酶标洗板机（深圳市汇松科技发展有限公司，货号：PW－812）；多功能酶标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司，货号：MB－530）；电热恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器有限公司，货号：DHP－500）。

1.4 分组造模与给药

将72只SD大鼠适应性喂养1周后，采用随机数表法分为空白组、模型组、利可君组、龟甲胶低剂量组、龟甲胶中剂量组和龟甲胶高剂量组。每组12 只，雌雄各半。除空白组外，其余各组大鼠腹腔注射环磷酰胺（给药剂量为400 mg/kg），每日1 次，连续3 d，从第4 天开始改为隔日1 次，再行注射3 次，建立再生障碍性贫血大鼠模型。

造模成功后，按照人与大鼠的体表面积换算相应剂量灌胃。空白组与模型组大鼠给予生理盐水；利可君组给予用生理盐水配置的40 mg/mL 利可君片溶液；龟甲胶低、中、高剂量组，分别给予0.063、0.126、0.252 g/mL 的龟甲胶药液。各组大鼠分别以10 mL/kg的剂量给予相应溶液灌胃，每日1次，连续15 d。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 外周血象测定

末次给药24 h 后，以10%水合氯醛按照35 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后，用手术剪沿大鼠下腹部正中剪开，于腹主动脉采血，以EDTA 抗凝后用全自动血液细胞分析仪检测外周血中的白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）和血小板（PLT）含量。

1.5.2 血清促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）测定

腹主动脉采血后静置2 h，以3 500 r/min 的速度离心20 min 后分离出血清，然后用移液枪吸取上层血清置于EP 管内，冰箱内保存待检。按照ELISA 试剂盒说明书方法测定大鼠血清中EPO的含量。

1.5.3 RT－qPCR法检测肾脏EPO mRNA表达

采用Trizol提取肾脏组织总RNA，以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA，采用SYBR 染料法进行扩增，反应条件：95 ℃变性10 min，然后95 ℃15 s，60 ℃30 s，共40 个循环，溶解曲线分析60～95 ℃，每0.5 ℃一循环检测荧光信号，以β－actin 为内参，采用2－ΔΔCt法分析目的基因的相对表达量。目的基因的序列及引物序列见表1。

表1 RT－qPCR反应引物序列及产物长度

1.5.4 脾脏组织细胞病理形态结构观察

取大鼠脾脏组织，多聚甲醛固定，24 h 后脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察脾脏组织细胞病理形态结构变化。

1.6 统计学方法

用SPSS 21.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，先检测各组数值符合正态分布，然后进行单因素方差齐性检验，再进行单因素方差分析，两两比较采用LSD 法，方差不齐者采用Dunnett－t3检验。P＜0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果2.1 各组大鼠外周血中WBC、RBC、HGB、PLT的含量比较

与空白组比较，模型组大鼠WBC、RBC、HGB 降低（P＜0.01），PLT 升高（P＜0.01）；与模型组相比，龟甲胶各组WBC、RBC、HGB 均升高（P＜0.01），利可君组大鼠WBC、RBC、HGB 升高（P＜0.01），给药各组PLT改善不明显（P＞0.05）；龟甲胶低剂量组对大鼠WBC升高显著高于龟甲胶中、高剂量组（P＜0.05），各个剂量龟甲胶组之间RBC 和HGB 含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠外周血中WBC、RBC、HGB、PLT的含量比较（±s）

表2 各组大鼠外周血中WBC、RBC、HGB、PLT的含量比较（±s）

注：与空白组比较，*P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05；与低剂量组比较，**P ＜0.05。

组别空白组模型组利可君组龟甲胶低剂量组龟甲胶中剂量组龟甲胶高剂量组PLT/（×1012/L）6.84±1.31 11.99±2.51*16.66±5.38 17.37±5.56 15.26±3.22 18.00±4.37 n 12 8 8 1 0 9 11 WBC/（×109/L）10.87±2.21 1.94±0.72*19.60±6.18 22.88±9.51△14.15±5.38△**17.87±4.80△**RBC/（×1012/L）6.76±0.35 4.18±0.86*5.75±0.61△6.00±0.57△5.43±0.51△6.12±0.41△HGB/（g/L）148.75±10.51 99.61±8.86*128.88±9.57△130.10±3.75△124.67±10.90△131.17±12.53△

2.2 各组大鼠血清EPO的含量比较

与空白组相比较，模型组大鼠血清中EPO 含量显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，龟甲胶各组及利可君组大鼠血清中EPO 含量显著增高（P＜0.01）；龟甲胶中、高剂量组较龟甲胶低剂量组增加更明显，但差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表3。

2.3 各组大鼠脾脏组织细胞病理形态结构比较

空白组大鼠脾脏结构致密，白髓与红髓结构清楚且分界明显，淋巴小结边界清晰，淋巴细胞排列致密整齐，细胞未见明显的分裂分化现象。模型组大鼠脾脏结构紊乱，红髓与白髓界限模糊不清，细胞出现明显的分裂分化现象。与模型组比较，利可君组及龟甲胶各组大鼠的脾脏均得到不同程度的修复，白髓与红髓结构与界限较为明显，细胞分裂分化现象比较少见。见图1。

图1 各组大鼠脾脏组织细胞病理形态结构（HE染色，×100）

2.4 各组大鼠肾脏EPO mRNA表达水平比较

与空白组相比较，模型组大鼠肾脏中EPO mRNA表达显著下降（P＜0.05）；与模型组相比，利可君组及龟甲胶各组大鼠肾脏中EPO mRNA 表达均显著上升（P＜0.05），龟甲胶中剂量组肾脏EPO mRNA 表达较龟甲胶高、低剂量组提升更多，但差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表3。

表3 龟甲胶对大鼠血清EPO含量及肾脏EPO mRNA表达的影响（±s）

表3 龟甲胶对大鼠血清EPO含量及肾脏EPO mRNA表达的影响（±s）

注：与空白组比较，*P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05。

组别空白组模型组利可君组龟甲胶低剂量组龟甲胶中剂量组龟甲胶高剂量组肾脏EPO mRNA 0.137±0.046 0.021±0.006*0.153±0.027△0.130±0.037△0.231±0.082△0.103±0.020△n 12 8 8 1 0 9 11血清EPO（ng/mL）0.339±0.046 0.021±0.039*0.464±0.100*△0.412±0.120△0.459±0.180*△0.455±0.151*

3 讨论

环磷酰胺作为临床上常用的一种烷化剂类化疗药物，能够通过发生烷化反应抑制DNA 复制和转录，造成骨髓抑制，从而导致贫血［6－7］。环磷酰胺腹腔注射造成大鼠贫血的方法简单易行，时间短，模型稳定［8］。本研究中模型组大鼠血常规检测显示，外周血中WBC、RBC、HGB 含量下降，这与钱宏梁等［9］的研究结果相似。笔者认为PLT含量的增加可能与对模型组及给药各组行腹腔注射及灌胃时，引起大鼠剧烈挣扎导致小血管破裂，从而激活大鼠凝血系统有关。

明代倪朱谟在《本草汇言》中记载，龟甲胶能治疗一切阴虚血虚之证［10］。中医学认为血是机体的重要组成部分，血液的生成主要有两方面：一是水谷精微化赤而形成血液，二是精血互生，肾主骨生髓，精髓化生为血。龟甲胶，味咸、甘，性微寒，归肝、肾、心经，因此常用来治疗血虚证［11－13］。研究发现，龟甲胶中含有大量的有益于人体的矿物元素，如Fe、Zn 以及人体所必需的蛋白质、氨基酸等［14－16］。本次实验中，通过给环磷酰胺造成贫血的大鼠灌服不同剂量的龟甲胶溶液，与模型组相比，龟甲胶组大鼠血象中WBC、RBC、HGB 均升高，且差异具有统计学意义（P＜0.01），高剂量组大鼠RBC、HGB 升高更明显，低剂量组WBC 升高更明显，但差异均无统计学意义（P ＞0.05）。

EPO又称红细胞刺激因子，是一种由165个氨基酸组成、分子量为34 000的内源性酸性糖蛋白激素，主要来源于胎儿时期的肝脏，出生后主要在肾脏合成，其生物学作用主要是促进红系祖细胞的增殖、分化和成熟［17－18］。本研究结果表明，与空白组相比，模型组大鼠血清中EPO含量和肾组织中EPO mRNA的表达均显著降低（P＜0.05）；与模型组相比较，利可君组和龟甲胶低、中、高剂量组大鼠血清中EPO含量和肾组织中EPO mRNA 的表达均显著增高（P＜0.05）。这可能是因为环磷酰胺具有细胞毒性，腹腔注射后损伤了大鼠的肾脏细胞，其中EPO mRNA表达降低，导致血液中EPO含量也相应降低。通过灌服不同剂量的龟甲胶后，龟甲胶中的成分对肾脏及骨髓进行了修复，EPO mRNA 表达升高，合成更多的EPO 入血。并且脾脏是人体最常见的免疫造血器官之一，造血功能低下会导致脾脏中骨髓细胞的积聚［19］。各组大鼠脾脏组织细胞病理形态显示，与空白组相比，模型组大鼠脾脏组织结构紊乱，红髓与白髓界限模糊不清，通过给予龟甲胶溶液后，各组大鼠脾脏的组织细胞结构均得到不同程度的修复。

综上所述，龟甲胶能够显著改善大鼠因环磷酰胺腹腔注射而导致的贫血，增加外周血中WBC、RBC 和HGB 的含量，提高大鼠肾脏中EPO mRNA 表达和血液中EPO 的含量，这为龟甲胶治疗贫血的机制研究与临床应用提供了一定的思路与理论基础。