石菖蒲对脑梗死大鼠认知功能障碍及神经细胞凋亡的影响及机制探讨

王彦平，张保朝，闻公灵，刘义锋，汪 宁，孙 军，茹 睿

脑梗死是因脑部血液循环障碍引起的局限性脑组织缺血、坏死或软化，可引起颅内高压、脑疝、昏迷，严重者可致死亡[1]。随着溶栓及介入治疗的不断发展，脑梗死的死亡率下降，但多数病人仍遗留不同程度的认知功能障碍、失语、偏瘫等神经功能缺失症状，不仅影响病人的生活质量，而且造成了一定的社会负担[2]。因此，如何减少脑梗死后的神经功能缺失，改善认知功能障碍成为医学研究热点。石菖蒲是具有开窍益智、镇静安神作用的中草药，在心脑血管疾病中有广泛应用[3]。研究表明，石菖蒲中含有的挥发油、有机酸等成分具有抗氧化损伤、镇静、抗惊厥等作用，可保护癫痫大鼠脑神经细胞，改善认知功能障碍[4-5]。目前虽有研究证实石菖蒲有神经保护作用，但关于其在脑梗死中的应用及相关机制研究较少。本研究通过线栓法阻断大脑中动脉建立脑梗死模型，观察石菖蒲对脑梗死大鼠认知功能障碍及神经细胞凋亡的影响，以期为脑梗死药物治疗研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠60只，4周龄，体质量180～220 g，购自广东省实验动物监测所，生产许可证号：SCXK(粤)2018-0044，使用许可证号SYXK(粤)2016-0122。自然光线下饲养，12 h昼夜节律，温度22～25 ℃，相对湿度50%～60%，自由进食水，实验前适应性饲养1周。

1.2 实验药物、主要试剂和仪器

1.2.1 药物 石菖蒲(北京同仁堂药店，批号160503)，尼莫地平注射液(西南药业股份有限公司生产，国药准字H20064494)。

1.2.2 实验试剂 兔抗大鼠糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)，磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)，β-连环蛋白(β-catenin)，p-β-catenin，促凋亡基因(B apoptosis cell matrixgene，Bax)，半胱天冬酶3(caspase-3，Casp3)多克隆抗体(美国Santa cruz公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.2.3 实验仪器 OLYMPUS显微镜(日本奥林巴斯公司)，Leitz1515型组织切片机(德国Leitz公司)，3550 UV酶标仪、7500实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪购自美国Bio-rad公司，Morris水迷宫(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司)。

1.3 脑梗死模型制备 采用改良Z-Longa线栓法造成大脑中动脉闭塞制作脑梗死模型，6 mL/kg 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于手术台上，颈部消毒备皮，沿正中线切开左侧颈部皮肤，逐层分离各层组织，暴露颈总动脉、颈外动脉，结扎颈外动脉远心端，微动脉夹夹闭颈内动脉和颈总动脉，于颈外动脉靠近颈总动脉分叉处剪一小口，将线栓自颈总动脉插入至颅内方向，深度18～20 mm至出现阻力，结扎线栓口下方，松开微动脉夹[6]。术后6 h实施Z-Longa评分法评价大鼠神经功能缺损情况，评分范围1～6分，1～3分为模型制作成功[7]。

1.4 分组及干预 60只大鼠适应性饲养1周后称重，随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、石菖蒲低剂量组、石菖蒲高剂量组，每组12只。除假手术组外均以改良Z-Longa线栓法阻断大脑中动脉制作脑梗死模型，假手术组术中仅暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，不阻断大脑中动脉，其余方法相同。造模期间假手术组、石菖蒲高剂量组、阳性对照组各死亡1只，模型组及石菖蒲低剂量组各死亡2只，剔除死亡大鼠后，假手术组11只、模型组10只、阳性对照组11只、石菖蒲低剂量组10只、石菖蒲高剂量组11只进入后续实验。

石菖蒲以双蒸水浸泡4 h，水煎3次，每次煎煮120 min，混匀3次滤液，浓缩至1 g/mL，置于4 ℃冰箱备用。按照人与动物等效剂量换算，在神经功能缺损评价后石菖蒲低剂量组即以石菖蒲药液0.6 g/kg灌胃，石菖蒲高剂量组以1.8 g/kg灌胃，阳性对照组以尼莫地平1 mg/kg灌胃，假手术组和模型组以生理盐水10 mL/kg灌胃，每天1次，连续30 d。观察药物干预完成后大鼠的精神状态、行走时肢体动作等行为学状态。

1.5 水迷宫实验评价大鼠认知功能 行为学观察后实施水迷宫实验，Morris水迷宫水池划分为4个象限，在任意象限中心水面下1.5 cm处放置一平台，距池壁20 cm，水中加入二氧化硅隐蔽平台，水池周围粘贴三角形图片为参照线索，依次从4个象限入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录爬上平台时间(逃避潜伏期)，超过60 s未找到平台则引导大鼠爬上平台，于平台上停留20 s，逃避潜伏期为60 s。4个入水点每天各训练1次，每一象限训练间隔时间为20 min，隐蔽平台实验连续5 d，记录第5天各组大鼠逃避潜伏期。第6天撤去平台，任选1个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录60 s内穿越平台位置次数、目标象限停留时间百分比。

1.6 Tunel染色观察梗死周边组织神经细胞凋亡情况 水迷宫实验结束后每组随机选取5只大鼠，以4%多聚甲醛经颈总动脉灌流固定，取左侧视交叉前后2 mm脑组织，常规石蜡包埋、切片，厚度4 μm，Tunel染色观察梗死周边组织神经细胞凋亡情况，阳染细胞核可见棕黄色颗粒。于显微镜下任选5个视野计数Tunel阳性细胞数。

1.7 实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测梗死周边脑组织GSK-3β、β-catenin、Bax、Casp3 mRNA表达 各组剩余大鼠中选取5只，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后开胸，胸穿针自左心室刺入，灌入4 ℃生理盐水，快速取出梗死半球脑组织，置于液氮中，保存于-80 ℃。脑组织在液氮中研磨，Trizol法提取总RNA，反转录获得cDNA，琼脂糖凝胶电泳法鉴定产物，实施实时荧光定量PCR，按照试剂盒说明书设定反应体系，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，按照2-△△CT计算目的基因的相对表达量。引物序列详见表1。

表1 引物序列

1.8 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin、Bax、Casp3蛋白相对表达量 取-80 ℃保存的梗死灶脑组织，冰上裂解，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，100 ℃水浴10 min，制备蛋白上样液，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转移至PVDF膜，加入封闭液室温摇床2 h，加入封闭液稀释一抗(1∶500)，4 ℃摇床孵育过夜，加入封闭液稀释二抗(1∶2 000)，常温孵育1 h，暗室中曝光、显影及定影。采用Image J软件分析图像进行灰度值分析，以目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值比值表示蛋白相对表达量，并计算p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin。

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学观察 假手术组精神状态良好，活动正常，无异常表现。模型组精神状态不佳，活动量减少，对侧肢体无力，行走时向对侧倾斜、旋转追尾，抬头困难，竖毛，提尾倒立时身体向对侧弯曲，重者瘫痪，无法自立性行走。阳性对照组存在抬头困难、竖毛、身体向对侧旋转追尾等表现，神经功能损伤较模型组轻。石菖蒲低剂量组与阳性对照组行为学表现相同。石菖蒲高剂量组有轻度对侧肌张力升高、竖毛、身体向对侧倾斜等表现，神经功能损伤较石菖蒲低剂量组轻。

2.2 各组逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留时间百分比比较 逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留时间百分比组间比较，差异均有统计学意义(P<0.001)；与假手术组比较，模型组、阳性对照组、石菖蒲干预组逃避潜伏期延长，穿越平台次数与目标象限停留时间百分比均减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和石菖蒲干预组逃避潜伏期缩短，穿越平台次数与目标象限停留时间百分比增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组和石菖蒲低剂量组比较，石菖蒲高剂量组逃避潜伏期缩短，穿越平台次数与目标象限停留时间百分比增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；阳性对照组与石菖蒲低剂量组逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留时间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留时间百分比比较(±s)

2.3 各组神经元凋亡情况比较 假手术组、模型组、阳性对照组、石菖蒲低剂量组、石菖蒲高剂量组凋亡神经细胞数分别为(6.20±1.32)个、(40.40±4.52)个、(33.60±3.20)个、(32.60±3.85)个、(15.40±2.80)个。神经细胞凋亡数组间比较，差异均有统计学意义(F=205.667，P<0.001)；与假手术组比较，模型组、阳性对照组、石菖蒲干预组凋亡细胞数更多，差异均有统计学意义(t值分别为23.907、25.870、21.567、9.986，P均<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和石菖蒲干预组凋亡细胞数更少，差异均有统计学意义(t值分别为4.127、4.078、15.230，P均<0.05)；与阳性对照组比较，石菖蒲高剂量组凋亡细胞数更少，差异有统计学意义(t=13.790，P<0.05)；阳性对照组与石菖蒲低剂量组凋亡细胞数比较，差异无统计学意义(t=0.290，P=0.773)。Tunel染色结果见图1。

图1 大鼠梗死灶周围组织神经细胞凋亡情况

2.4 各组GSK-3β、β-catenin、Bax、Casp3 mRNA相对表达情况 各组GSK-3β、β-catenin mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。各组Bax、Casp3 mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.001)。与假手术组比较，模型组Bax、Casp3 mRNA相对表达量更高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和石菖蒲干预组Bax、Casp3 mRNA相对表达量更低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组和石菖蒲低剂量组比较，石菖蒲高剂量组Bax、Casp3 mRNA相对表达量更低，差异均有统计学意义(P<0.05)；阳性对照组与石菖蒲低剂量组Bax、Casp3 mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组GSK-3β、β-catenin、Bax、Casp3 mRNA相对表达量比较(±s)

2.5 各组p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相对表达量比较 各组p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。与假手术组比较，模型组p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相对表达量更高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和石菖蒲干预组p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相对表达量更低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组和石菖蒲低剂量组比较，石菖蒲高剂量组p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相对表达量更低，差异均有统计学意义(P<0.05)；阳性对照组与石菖蒲低剂量组p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表4、图2。

表4 各组p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相对表达量比较(±s)

图2 各组Western Blot检测GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin、Bax、Casp3蛋白相对表达量

3 讨 论

脑梗死的发生机制是血液成分改变，出现动脉粥样硬化及血栓，血管狭窄或阻塞引起脑部供血障碍，脑组织发生急性缺血、缺氧，梗死病灶脑细胞因缺血、缺氧而水肿、坏死，并生成大量自由基，造成神经细胞凋亡，出现认知功能障碍、偏瘫等神经功能缺损表现[8]。在脑梗死的治疗中，如何抑制梗死病灶周边缺血半暗带的神经细胞凋亡，阻止病情的进一步发展是改善神经功能障碍的重要措施[9]。中药在治疗脑梗死方面有悠久的历史，并积累了丰富的经验，且随着现代医学的发展，其优势逐渐被临床认知。石菖蒲为有醒脑开窍作用的中草药，在心脑血管疾病的治疗中有广泛应用，为脑梗死的药物治疗研究提供了新的方向。

石菖蒲是天南星科菖蒲属植物石菖蒲的根块茎，属于芳香开窍类中药，具有醒神益智、开窍醒脑、理气活血、燥湿化痰等功效，主治因中风、牙关紧闭、眼合及手足拘挛症[10]。石菖蒲的主要有效成分为挥发油β-细辛醚和丁香酚，有镇静、抗惊厥、抗抑郁、降血脂、抑制血小板聚集、抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种作用[11]。章程鹏等[12]研究显示，石菖蒲能够修复睡眠剥夺引起的大鼠海马区神经细胞损伤，减轻炎症反应，改善大鼠的记忆功能。体外实验证实，石菖蒲能减少脂多糖诱导的人脑神经胶质细胞中一氧化氮浓度，抑制过氧化损伤，达到脑保护作用[13]。本研究结果显示，干预后模型组大鼠精神状态差，活动量少，且有行走时向对侧倾斜，有旋转追尾、抬头困难、竖毛、瘫痪等显著的神经功能缺损表现。阳性对照组及石菖蒲低剂量组神经功能缺损表现较模型组轻，石菖蒲高剂量组神经功能缺损状态较低剂量组轻；与模型组比较，阳性对照组和石菖蒲干预组的逃避潜伏期更短、神经细胞凋亡数更少，穿越平台次数与目标象限停留时间百分比增加；与阳性对照组及石菖蒲低剂量组比较，石菖蒲高剂量组的逃避潜伏期更短、神经细胞凋亡数更少，穿越平台次数与目标象限停留时间百分比增加，说明石菖蒲可减轻脑梗死大鼠神经功能损伤，抑制神经细胞凋亡，改善认知功能障碍。

神经细胞凋亡是造成脑梗死认知功能障碍的主要原因，GSK-3β/β-catenin信号通路在神经细胞凋亡中发挥重要的转导作用[14]。β-catenin是一种多功能蛋白，通过与细胞骨架的相互作用协助细胞对细胞外信号做出反应[15]。GSK-3β是β-catenin上游的关键酶，GSK-3β的磷酸化可使β-catenin的降解复合体失活，使β-catenin磷酸化，易位进入细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子结合，诱导细胞损伤及凋亡[16]。朱明等[17]研究发现，GSK-3β/β-catenin信号通路的激活可使大鼠海马神经元细胞形态发生改变，造成认知功能障碍。Darshit等[18]研究发现抑制GSK-3β/β-catenin信号通路的激活可上调GAP43、Ngn1和NeuroD2基因转录，维持神经元存活。Casp3是细胞凋亡信号通路中的关键调节位点，Casp3的激活可进一步激活下游信号调节因子促进细胞凋亡[19]。Bax是细胞主要的凋亡基因，可通过增加线粒体膜及细胞膜脂质双分子层的通透性，促进促凋亡因子进入细胞线粒体，诱导细胞凋亡[20]。本研究结果显示，与模型组比较，阳性对照组、石菖蒲干预组p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值，Bax、Casp3 mRNA及蛋白相对表达量降低；与阳性对照组及石菖蒲低剂量组比较，石菖蒲高剂量组p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值，Bax、Casp3 mRNA及蛋白相对表达量降低，提示石菖蒲可抑制脑梗死大鼠认知功能障碍、阻止神经细胞凋亡，其机制可能与抑制GSK-3β/β-catenin信号通路的激活有关。

综上所述，石菖蒲能改善脑梗死大鼠的认知功能障碍，抑制神经细胞凋亡，其机制可能与抑制GSK-3β/β-catenin信号通路的激活有关，为与石菖蒲相关的治疗脑梗死认知功能障碍的药物研发提供依据。