荧光探针用于食品添加剂定量分析的实验设计

张建坡，金 丽，金 星，张志会，钟方丽，马明硕

(吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022)

分析化学从分析的原理方面分，可以分为化学分析和仪器分析，它的主要任务是根据物质运动和变化的理论，创建有关的实验技术、研制仪器设备、制定分析方法，它对国民经济的发展、国防力量的壮大和科学技术的进步各方面有着举足轻重的作用[1-2]。分析化学实验为我校化学类专业的必修课程。目前，主要内容以滴定分析、色谱实验、电化学实验为主，这些实验内容与基础实验相类似，缺乏创新性；而光谱类实验(傅里叶红外光谱实验和紫外可见吸收光谱实验)主要为验证性实验，缺乏与实际生活的联系，导致学生学习兴趣下降，未能取得良好的教学效果[3-5]。近年来，荧光探针，基于量子点类荧光强度的变化对食品添加剂进行定量分析，被广泛研究[6-11]。因此，结合教师科研课题，基于胭脂红对石墨烯量子点的荧光猝灭作用，引导学生设计并完成一种荧光猝灭法定量分析饮料中胭脂红含量的分析方法的研究型实验。本实验内容包括实验条件的选择(溶液酸度和反应时间对反应的影响)、工作曲线的建立、猝灭机理的探讨和实际样品的分析，使学生不仅学会使用荧光分光光度计，而且学会利用origin软件对荧光数据进行处理和分析。

一、实验仪器和试剂

(一)实验仪器

天津港东F-280荧光分光光度计；岛津UV-2550紫外可见分光光度计；德国IKA RCT恒温磁力搅拌器和部分小型玻璃仪器，均为实验室常用仪器。

(二)实验试剂

胭脂红购自天津开复化学试剂有限公司；氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均购自国药集团化学试剂有限公司。所有的试剂均为分析纯，使用前未做任何处理。

二、实验教学方案设计

(一)溶液配制

(1)通过柠檬酸裂解法得到浓度为0.5 mg·L-1的石墨烯量子点，已为学生准备好样品，样品的平均荧光寿命为6.14 ns。

(2)准确称取0.01 g胭脂红固体，定容于100 mL容量瓶中，得到胭脂红储液(0.1 g·L-1)。

(3)配制浓度均为0.1 mol·L-1的氢氧化钠和盐酸溶液；准确配置pH=7.0、C=1 mol·L-1的缓冲溶液(使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)。

(二)荧光发射光谱的测定和紫外-可见吸收光谱的测定

荧光光谱测试条件：激发狭缝和发射狭缝均为5 nm，激发波长为367 nm，测试范围为400～650 nm；紫外-可见吸收光谱测试范围300～650 nm。

(三)实验条件的选择

1.溶液酸度的影响

取10个比色管，向其中均加入0.1 mL石墨烯量子点和40 μL的胭脂红储液，将加入胭脂红的溶液用盐酸和氢氧化钠溶液依次调节溶液pH为2～11后，定容至10 mL，得到1～10号溶液，室温下孵育5 min后，测得荧光发射光谱。

同时，取10个比色管，向其中均加入0.1 mL石墨烯量子点，用盐酸和氢氧化钠溶液依次调节溶液pH为2～11后，定容至10 mL，得到1～10号溶液，室温下孵育5 min后，测得荧光发射光谱，作为对照荧光强度。

2.反应时间的影响

取2个比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子点，分别向其中加入0 μL和40 μL的胭脂红储液，用pH为7的缓冲溶液定容至10 mL，得到1和2号溶液，每隔2 min测一次2号溶液的荧光发射光谱，测1号溶液的荧光发射光谱作为对照。

(四)猝灭机理探讨

1.UV-vis吸收光谱

取2个比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子点，分别向其中加入0 μL和40 μL的胭脂红储液，用pH为7的缓冲溶液定容至10 mL，得到1和2号溶液，分别测得两个溶液的紫外-可见吸收光谱。

2.变温实验及kq值的比较

取6个比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子点，并加入一系列体积(0、10、20、30、40和50 μL)的胭脂红储液，用pH为7的缓冲溶液定容至10 mL，得到1～6号溶液，室温下孵育5 min后，将溶液依次置于20和30 ℃水浴中10 min后，测得荧光发射光谱。

根据Kq=KSV/τ0，其中KSV由变温实验的斜率求得，τ0=6.14 ns(样品的平均荧光寿命)，求得kq值再与最大扩散碰撞速率常数(2.0×1010L·mol-1·s-1)进行比较。

(五)标准曲线的绘制

取8个比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子点，并加入一系列体积(0、10、20、30、40、50、60和70 μL)的胭脂红储液，用所配置的缓冲溶液统一定容至10 mL，在经过5 min室温孵育后，分别测定其荧光发射光谱。

(六)实际样品分析

(1)移取20 mL饮料于50 mL烧杯中，置于电炉上微沸10 min以去除溶液中的二氧化碳，冷却后，备用，得样品A溶液。

(2)取2个比色管，先加入石墨烯量子点0.1 mL，再分别加入样品A溶液0 mL和0.4 mL，用pH为7的缓冲溶液定容至10 mL，5 min后测得荧光发射光谱，并根据标准曲线计算得到样品中胭脂红的含量，单位为g/mL。

三、实验结果与讨论

(一)溶液酸度和孵育时间对反应的影响

首先研究了pH值对反应体系荧光强度(F0/F)的影响(图1)。F0/F值随着pH值的增大呈现而先增大后减小的趋势，在pH=7时出现最大值，因而测试pH值定为7；其次研究了孵育时间对F0/F的影响。当孵育5分钟后，该体系的荧光强度变化(F0/F)趋于平稳，因而选择孵育时间为5分钟。

pH

(二)猝灭机理探讨

1.UV-vis吸收光谱

打开电脑和紫外-可见分光光度计，测试前预热20 min。双击测试软件图标，仪器完成自检后，设置测试范围为200～800 nm，先测空白溶液得到基线，之后测试样品。

测试结果如图2所示，未加入胭脂红时GQDs的紫外吸收峰位于334 nm(黑线)，加入胭脂红后，GQDs的紫外吸收峰发生了明显的蓝移(红线)，这表明GQDs和胭脂红之间形成了新的复合物。

Wavelength/nm

2.变温实验

选取20 ℃、30 ℃和40 ℃3个温度进行实验测定。依据方程F0/F=KSV[C]+b对所测荧光光谱数据进行分析，其中F0代表GQDs的荧光强度，F为加入胭脂红后GQDs的荧光强度，C表示胭脂红的浓度。随着孵育温度的增加，拟合直线的斜率依次减小，这是因为随着温度增加，所形成的石墨烯量子点/胭脂红复合物的稳定性依次减弱。

3.比较kq值

通过方程Kq=KSV/τ0计算，τ0=6.14 ns。通过计算可知20 ℃时KSV为1.60×105(R2为0.997)，则Kq为2.6×1014mol·L-1·s-1，30 ℃时KSV为1.47×105(R2为0.989)，则Kq为2.4×1014mol·L-1·s-1，40 ℃时KSV为1.29×105(R2为0.991)，则Kq为2.1×1014mol·L-1·s-1该数值远远大于2×1010mol·L-1·s-1(最大动力学猝灭常数)。

综上，依据紫外吸收光谱分析、变温实验分析和kq值的比较，从理论上可以判定胭脂红对GQDs的荧光猝灭为准静态猝灭过程。其反应机理可以阐述如下：胭脂红作为一种有机染料，每一个分子均具有—SO3-和—OH基团，而石墨烯量子点表面具有—COOH，石墨烯量子点表面的—COOH与胭脂红表面的—SO3-之间具有较强的相互作用(如图3所示)，因而形成二者的复合物，引发GQDs基态化合物的能量散失，造成GQDs荧光发射强度降低，即GQDs的荧光猝灭。

图3 石墨烯量子点与胭脂红作用机理模拟图

(三)标准曲线的绘制

在最优条件下，发现胭脂红浓度为0.165 6～1.158 9 μmol·L-1的范围内，石墨烯量子点荧光强度的降低(F0/F)与胭脂红浓度之间具有良好的线性关系(如图4所示)，回归方程为F0/F=1.905 3[胭脂红]+ 0.742 1，相关系数为0.997。通过方程LOD=(3.3 σ·k-1)计算得检出限(LOD)为0.052 34 μmol·L-1，σ代表标准偏差，k代表回归方程的斜率。通过5次重复检测1.5 μg·L-1的胭脂红，得到相对标准偏差(2.8%)，说明该方法具有良好的重复性。

Concentration of Ponceau 4R/(μmol·L-1)

(四)实际样品分析

1.做图法求算饮料中胭脂红的含量

如图5所示，实际样品引起的GQDs荧光强度变化的F0/F值为1.968 8，通过做图法可知胭脂红的浓度为0.643 8 μmol·L-1；该浓度为原饮料溶液0.4 mL定容至10 mL，稀释后所含胭脂红的浓度，原饮料中含有胭脂红的浓度应换算为0.643 8×604×10-4/4=9.721 mg·L-1。通过本实验让学生学会使用origin做图，掌握标准曲线法作图法求算未知样品的含量。

Concentration of Ponceau 4R/(μmol·L-1)

2.计算法求算饮料中胭脂红的含量

依据F0/F=1.968 8，根据回归方程F0/F=1.905 3[胭脂红]+ 0.742 1，胭脂红的浓度为0.643 8 μmol·L-1；该浓度为原饮料溶液0.4 mL定容至10 mL，稀释后所含胭脂红的浓度，原饮料中含有胭脂红的浓度应换算为0.643 8×604×10-4/4=9.721 mg·L-1。

四、结 语

通过食品添加剂对石墨烯量子点荧光强度变化的实验探究，设计了一个定量分析饮料中胭脂红含量的综合型实验。在实验过程中，学生需要独立完成溶液的配制、仪器调试、测试和实际样品分析等工作；实验结束后需运用origin软件完成做图、对实验数据进行分析处理，以及结合谱图和计算结果完成对反应机理的探讨，提高了学生的动手能力和解决实际问题的能力。将教师科研课题引入到本科生教学中，让学生了解到科学研究最终的目的是为了解决生活中的实际问题，使学生体会到学以致用的乐趣。