UPLC-PDA测定白术中两种活性成分及不同产地药材质量研究*

邢会香 张学花 刘红 肖秋霞 朱海俊 郭静

(青海普兰特药业有限公司，青海 西宁 810000)

白术是常用的补益药，为菊科植物白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根茎，性温，味甘、苦[1]，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的功效，可用于脾虚食少，腹胀泄泻，痰饮眩悸，水肿，自汗，胎动不安[2]。白术的化学成分主要有挥发油、多糖、内酯类成分等[3]，内酯类成分具有抗炎、抗癌、促进营养物质吸收和调节胃肠道功能的作用[4]，《中华人民共和国药典》2015年版[5]与2020年版[2]白术药材项下均未有含量检测项，故本研究选择白术内酯Ⅱ、Ⅲ为研究对象并建立其在白术中的含量测定方法。相关文献含量多以HPLC测定白术内酯类成分[6-9]，HPLC进样体积大、流速大、分析时间长，本研究采用UPLC-PDA测定白术内酯类成分，较HPLC更节省时间、溶剂，且能通过峰纯度准确排除阴性干扰，提高检测灵敏度、缩短检验周期。采用本研究方法分析了16批市场主流药材的质量情况，也为药材的资源评价和合理使用提供科学参考。

1 材料

1.1仪器 ACQUITY UPLC H-CLASS超高液相色谱仪(ACQUITY UPLC PDA eLambda检测器，Waters)；MS105型(十万分之一)电子分析天平(METTLER TOLEDO)；ML-204T-02型(万分之一)电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；JP-080ST型超声清洗仪(深圳市洁盟清洗设备有限公司有限公司)；TG16-WS型高速离心机(常州金坛良友仪器有限公司)。

1.2药材与试剂 白术内酯Ⅱ对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111976-201501，纯度：99.9%)；白术内酯Ⅲ对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111978-201501，纯度：99.9%)；白术药材共16批次，经鉴定均为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎；甲醇、乙腈均为进口色谱纯，磷酸等其他试剂均为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1色谱条件[10-15]色谱柱：CORTECS UPLC T3(100×2.1 mm，1.6 μm)；流速为0.35 mL·min-1；检测波长为220 nm；进样量为5 μL;以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B,按照表1进行梯度洗脱。理论板数按白术内酯Ⅲ峰计算应不低于4500。

表1 梯度洗脱程序

2.2溶液的制备

2.2.1空白溶液 70%甲醇水溶液。

2.2.2对照品溶液 精密称定白术内酯Ⅱ对照品10.54 mg、白术内酯Ⅲ对照品10.42 mg分别置于100 mL容量瓶中，加70%甲醇水溶液使溶解并定容至刻度，摇匀，分别精密移取上述溶液各10 mL置于同一100 mL容量瓶中，加70%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.3供试品溶液 取本品粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液50 mL，称定重量，超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，离心(10000 r·min-1，5 min)，滤过，取续滤液，即得，进样前用0.22 μm微孔滤膜过滤。

2.3系统适用性试验 按照2.2方法分别制备得到对照品溶液和供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱。结果显示对照品连续进样5针，白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ峰面积的RSD分别为0.1%、0.1%，保留时间的RSD分别为0.3%、0.4%，对照品和供试品溶液中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ色谱峰与前后杂质峰分离度均大于1.50，白术内酯Ⅲ色谱峰的理论塔板数均不小于4500，提示该色谱系统适用性良好。

2.4专属性试验 按照2.2方法分别制备得到空白溶液、对照品溶液、供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱，见图1。结果显示空白溶液对主色谱峰无干扰，对照品和供试品溶液中主色谱峰保留时间一致。另采用PDA检测器对对照品溶液、供试品溶液中的主色谱峰进行峰光谱扫描和纯度检测。结果显示对照品和供试品溶液中主色谱峰纯度角度小于纯度阈值，纯度符合要求，具体数据见表2，本试验提示该方法专属性良好。

注：A.空白溶液；B.白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ对照品；C.供试品溶液；1.白术内酯Ⅲ；2.白术内酯Ⅱ

表2 白术和对照品主色谱峰纯度角度和纯度阈值列表

2.5线性关系考察

2.5.1白术内酯Ⅱ对照品线性关系考察 精密称定白术内酯Ⅱ对照品10.54 mg，加70%甲醇水溶液制成105.3 μg·mL-1的白术内酯Ⅱ对照品母液。分别精密量取适量上述母液，稀释配制成浓度为0.4212、2.106、10.53、31.59、52.65 μg·mL-1的系列对照品溶液。按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱。以质量浓度(X,μg·mL-1)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性拟合，得回归方程Y=56920X+19.391(r=1.0000)。结果表明，白术内酯Ⅱ在0.4212～52.65 μg·mL-1线性关系良好。

2.5.2白术内酯Ⅲ对照品线性关系考察 精密称定白术内酯Ⅲ对照品10.42 mg，加70%甲醇水溶液制成104.1 μg·mL-1的白术内酯Ⅲ对照品母液。分别精密量取适量上述母液，稀释配制成浓度为0.4164、2.082、10.41、31.23、52.05 μg·mL-1的系列对照品溶液。按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱。以质量浓度(X,μg·mL-1)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性拟合，得回归方程Y=37992X+20.82(r=1.0000)。结果表明，白术内酯Ⅲ在0.4164～52.05 μg·mL-1线性关系良好。

2.6重复性试验 由实验员(甲)分别取白术(河北省保定市安国西伏落镇，批号：B201)药材粉末(过三号筛)约0.5 g，平行6份样品，精密称定，按照2.2.3方法制备得到6份供试品溶液。按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱。结果白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ平均含量分别为0.069%和0.050%，RSD分别为1.1%、1.1%，提示该方法重复性良好。

2.7中间精密度试验 由另外一名实验员(乙)分别取白术药材粉末(过三号筛)约0.5 g，平行6份样品，精密称定，按照2.2.3方法制备得到6份供试品溶液。按2.1项下色谱条件用另一台G18QSM448A超高液相色谱仪进行测定，记录色谱。结果甲乙两名实验员在不同仪器上测得白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ含量的RSD分别为2.4%、3.6%，提示该方法中间精密度良好，具体数据见表3。

表3 中间精密度试验结果(n=9)

2.8加样回收试验 取已知含量的白术药材粉末(过三号筛)约0.25 g，平行9份样品，分为3组，分别加入3个质量分数水平(50%、100%和150%)的白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ对照品。按照2.2.3项下溶液制备方法制备得到9份供试品溶液。按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱并计算加样回收率，结果见表4。

表4 回收率试验结果(n=9)

2.9稳定性试验 取2.2.3项下供试品溶液适量，分别置于室温下放置0、1、2、4、6、8、12、24 h时按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱。结果供试品中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ色谱峰峰面积的RSD值分别为1.2%和0.7%。结果表明供试品在70%甲醇水溶液中24 h内稳定性良好，具体数据见表5。

表5 稳定性试验结果

2.10耐用性试验 本研究中耐用性试验是通过微调测试条件中的单个变量观察结果的不受影响程度，改变的测试变量包括流动相组成、流速、柱温、色谱柱。结果表明该方法耐用性良好，具体数据见表6。

表6 耐用性试验结果

2.11样品含量测定 取16批次白术样品适量，按照2.2.3方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进行测定，双样双针，记录色谱并计算样品含量，结果见表7。

表7 白术样品中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ含量测定结果(n=2)

3 讨论

3.1检测波长的选择 对白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ对照品溶液分别进行190～400 nm扫描，结果白术内酯Ⅱ在221 nm处有最大吸收，白术内酯Ⅲ在193,220 nm处有最大吸收，兼顾白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的最大吸收，最终选择220 nm为检测波长。

3.2色谱条件的选择 本研究考察了柱温、流速、进样体积对色谱峰分离的效果，结果当柱温30 ℃、流速0.30 mL·min-1、进样体积10 μL时峰形均未达到要求，柱温40 ℃、流速0.35 mL·min-1、进样体积5 μL时峰形符合要求。

3.3提取条件的选择 查阅文献，提取条件有甲醇、乙醇等溶剂超声或回流处理[9,16-20]，故本研究考察了不同比例和不同类别的提取溶剂(30%、50%、70%甲醇水溶液，50%乙腈水溶液和50%乙醇水溶液)进行提取，同时考察了不同提取方式(超声和回流)、不同提取时间(10、20、30 min)和不同溶剂量(10、25、50、100 mL)对白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ含量的影响，结果发现提取溶剂和溶剂量对结果有较显著的影响，而提取方式和提取时间对含量结果影响较小，因此最终确定最佳提取条件为50 mL 70%甲醇水溶液超声提取10 min。

3.4不同产地药材质量的差异 本研究采用UPLC-PDA对浙江省、河北省、安徽省不同地区的白术药材同时测定了白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量，结果发现16批药材中浙江省金华市磐安县玉山镇和安徽省亳州市谯城区古井镇的白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ总含量较高，但该两个省其它地区药材含量均参差不齐，差异较大，只有产地河北的整体均一性较好。虽白术为浙江省的道地药材，但整体含量偏低的较多，这可能与药材采收时间、生长年限等因素有关。

综上所述，该方法操作简单，节省成本，可以同时测定白术中白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的含量且重复性、准确度及耐用性良好，本研究为今后中国药典增加含量测定指标，控制白术药材质量奠定了良好的基础。