基因编辑技术及其在桑树育种中的应用前景展望

黄 锦，李 勇，于 翠，朱志贤，莫荣利，董朝霞，胡兴明，邓 文

（湖北省农业科学院经济作物研究所，武汉 430064）

桑树（Morus albaL.）是中国最常见的园艺植物之一，广泛分布于中国的各省（市、自治区）［1］。桑树是家蚕的惟一食用植物，中国自古以来就用桑叶喂蚕。蚕桑产业至今仍是中国的优势产业，因其具有较高的经济回报和较大的就业潜力，在中国经济和社会发展中有着重要地位［2］。桑树是多用途的经济树种，在食用、药用和生态修复等方面具有较高的价值［3］。随着桑树的多种功能被重视，适用于不同用途的桑树育种迎来了前所未有的挑战，与传统的木本植物育种一样，由于高杂合度和长世代周期，桑树育种极为缓慢和困难［4］。伴随着生物技术、分子生物学和生物信息学的快速发展，分子育种、转基因、基因编辑技术等一大批新技术被应用到植物育种工作中，极大地提高了植物育种的效率。目前，传统育种方法和新型育种手段相结合培育优良植物品种已成为趋势［5］。其中，近年来不断发展的基因编辑技术被人们广泛关注，尤其是CRISPR/Cas9 基因编辑技术［6］，它不仅能够对目标基因进行精准修饰，而且具有成本低廉、操作简单、编辑效率高等优点，已被大量应用于植物基因组功能和遗传改良等相关研究。本文主要综述基因编辑技术的类型、作用机制及CRISPR/Cas9 基因编辑技术在植物领域中的应用，并对CRISPR/Cas9 基因编辑技术在桑树育种中的应用前景进行展望，以期为桑树多元化种质创新提供借鉴和思路。

1 基因编辑的类型与作用机制

基因编辑技术是指在基因组水平上对靶基因位点进行精确定向修饰的新技术［6］。基因编辑技术根据其所用的特异性核酸酶的不同可分为3 类：锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）［7］、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）［8］和规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR/Cas）系统［9］。这些技术都是通过特异性识别目标基因的特定DNA 序列，利用特异性核酸酶（SSN）在靶位点产生DNA 双链断裂（DSB）。植物的内源性修复系统可以通过非同源端连接（NHEJ）和同源重组（HR）2 种方式来修复DSB，最终导致基因的敲除、替换和插入［10］。3 种基因编辑技术识别目的DNA的原理也有所不同，其中ZFN 和TALEN 利用蛋白质识别目的DNA，而CRISPR/Cas利用RNA 识别目的DNA［11］。

1.1 ZFN

ZFN 是一种序列特异性核酸酶，由人工设计的锌指DNA 特异性结合区域与限制性内切酶FokI的DNA 非特异性切割域融合而成［12］。每个锌指单元识别3 个碱基对（bp）的目标序列，通常多个锌指单元组合成一组，与特定的DNA 序列结合［13］。由于FokI 是以二聚体的状态发挥其核酸内切酶的切割功能，典型的ZFN 被设计为2 个正反向排列的ZFN单体，结合在18-bp 或24-bp 序列上且两单体间隔5～7 个核苷酸，FokI 结构域在2 条靶序列间切割基因组DNA，造成DSB［14］。修复DSB 则会造成目标基因组DNA的插入、缺失、替换等，实现基因靶位点的精确编辑。但是，基因组中ZFN 识别靶向位点的有限性、构建的复杂性、高且易变的脱靶率以及分析所需的高成本和高技术限制了其应用［15］。

1.2 TALEN

与ZFN 类似，TALEN 由可自定义的类转录激活效应因子（TALE）蛋白DNA 特异性结合域与限制性内切酶FokI 融合而成［16］。TALE 蛋白是由植物致病菌黄单胞菌属（Xanthomonas）分泌的蛋白，具有转录激活功能，可以改变宿主的基因表达［17］。TALE 蛋白利用其DNA 识别结构域与目标基因组中靶位点特异性结合，形成TALE 蛋白二聚体发挥其核酸内切酶的功能，在TALEN 结合的序列间隔区域发生DSB，从而诱发植物DNA 损伤修复机制［18］。TALE蛋白中的氨基酸重复序列高度相同，其中第12 位和第13 位的双残基被称为重复可变双残基（RVD）。TALEN 以一RVD 对一核苷酸的方式靶向位点。通常情况下，TALEN 发挥其基因编辑功能需要一对TALE 单体结合在14～18 bp 且间隔50～60 bp的目标序列上［19］。相比ZFN，TALEN 更容易设计且对靶基因的特异性识别效率更高。但是RVD的高重复次数使得TALEN的构建具有挑战性，另外构建载体过大、成本高等不足同样限制了其在植物中的广泛应用。

1.3 CRISPR/Cas 系统

CRISPR/Cas 系统由CRISPR 重复间隔序列和Cas 蛋白组成，是细菌和古细菌中的一种RNA 介导的适应性免疫系统，通过切割入侵者的核酸基因组来防御噬菌体［20］。CRISPR/Cas 系统根据Cas 基因的数目和功能分为两大类，又根据各自的Cas 基因进一步细分为6 种类型［21］。第一类CRISPR/Cas 系统（类型I、III 和IV）需要多个Cas 蛋白形成复合体行使基因编辑功能，而第二类系统（类型II、V 和VI）通过单个Cas 蛋白与CRISPRRNA（crRNA）的复合体完成基因编辑［22，23］。第二类Ⅱ型的CRISPR/Cas 系统因其结构较简单，容易操作，是目前研究最透彻、应用最广的CRISPR/Cas 基因编辑系统，比如CRISPR/Cas9 基因编辑技术［9］。

CRISPR/Cas9 系统由反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）、crRNA 和Cas9 蛋白组成。前体CRISPR RNA（pre-crRNA）被转录后，由tracrRNA 和Cas9蛋白协助被加工成成熟的小crRNA。tracrRNA、crRNA 和Cas9 蛋白形成复合体，tracrRNA 和crRNA具有序列互补性可形成部分双链结构，保持复合体的稳定［24］。CrRNA 被用作引导序列，基于序列互补性将Cas9蛋白引导到靶位点序列区域，在靶位点序列区域存在2～5 bp的保守碱基序列（PAM），是tracrRNAcrRNA-Cas9 复合体识别靶位点的关键［9，25，26］。Cas9蛋白拥有2 个核酸酶结构域（RuvC 和NHN），在到达靶位点后，其HNH 结构域能够切割与crRNA 互补的DNA 链，RuvC 结构域切割非互补的DNA 链，形成DSB［27，28］。依靠植物的内源性修复系统修复DSB，实现基因靶位点的精确编辑。

为了简化CRISPR/Cas9 系统，将tracrRNA 和crRNA的核心序列用四碱基连接环构成一个sgRNA（single guide RNA），在sgRNA的引导下Cas9 蛋白仍然能够特异性地切割靶DNA，这些改进使得CRISPR/Cas9 基因编辑技术操作更加简便，更利于该技术的广泛应用［29-31］。虽然CRISPR/Cas9 基因编辑技术成功应用案例越来越多，但该技术仍有编辑位点受限、脱靶等缺点。随着对CRISPR/Cas 系统研究的深入，新的CRISPR/Cas 系统不断地被发现，如CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/Cas12b系统和CRISPR/Cas13a系统。CRISPR/Cpf1 系统和CRISPR/Cas12b 系统提高了系统的特异性，扩大了识别应用的范围，弥补了CRISPR/Cas9 技术的不足［32，33］；CRISPR/Cas13a 系统具有在RNA 水平进行基因编辑的能力，进一步扩展了CRISPR/Cas 系统的编辑范围［34］。

2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术在植物育种中的应用

在植物育种中，CRISPR/Cas9技术主要通过基因的敲除、插入、替换和基因表达调控等手段，改善植物的多种性状。近年来，已有20多个属的植物成功应用了CRISPR/Cas9 基因编辑技术［35］。CRISPR/Cas9基因编辑技术在大田作物和林木育种的应用也越来越多，在提高产量、改良品质、培育抗生物胁迫及非生物胁迫新品种等领域都具有良好的应用前景。

2.1 CRISPR/Cas9 基因编辑技术在大田作物中的应用

2013 年，Shan 等［36］利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术在水稻中定点敲除OsPDS基因，获得的突变体拥有矮小白化的表型。此后，CRISPR/Cas9 基因编辑技术在水稻中得以应用，致力于改善水稻的产量、品种及抗性等。Xu 等［37］敲除水稻粒重基因OsGW2、OsGW5和OsTGW6后，显著提高稻谷的粒长、粒宽和粒重。Zhou 等［38］敲除水稻中对产量负调控的基因OsGS2、OsGS3和OsGn1a，发现各单基因突变产量都显著增加，而且多基因突变对增产有加性效应。Ma等［39］敲除水稻蜡质基因OsWx，成功获得糯性稻米。Sun 等［40］利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术精确替换水稻中淀粉分支酶基因OsSBEIIb，使得水稻的直链淀粉含量显著增加。OsBadh2基因是水稻香味相关基因，杨平等［41］敲除水稻中OsBadh2基因，水稻突变体中香味物质含量显著增加。王加峰等［42］靶向敲除水稻中乙烯反应因子基因OsERF922，获得的突变体在靶位点存在不同的插入或缺失，突变体在苗期和分蘖期均显著减少了稻瘟病的发病率。徐鹏等［43］靶向敲除水稻基因OsPi21、OsERF922和OsPita，获得的三基因突变体显著增强对部分稻瘟病生理小种的抗性。

CRISPR/Cas9 技术在玉米、小麦、大豆等大田作物中的应用也日趋广泛。Shi等［44］利用CRISPR/Cas9技术将玉米基因ZmGOS2的启动子精确替换玉米乙烯负调控因子ZmARGOS8的启动子，编辑后的突变体的玉米产量不受影响，显著增加了玉米的抗性能力。Li 等［45］通过靶向编辑玉米温敏核雄性不育基因ZmTMS5，获得的突变体拥有热敏雄性不育性状。Svitashev 等［46］通过CRISPR/Cas9 技术精确编辑玉米乙酰乳酸合成酶ZmALS2，赋予玉米新材料对除草剂氯磺隆的抗性。Zeng 等［47］靶向敲除玉米耐寒基因负调控因子ZmMPK8，其突变体增强了玉米幼苗的耐寒性。Wang 等［48］利用CRISPR/Cas9 技术对小麦3 个同源基因TaMLO进行敲除，获得的突变体显著增强了对白粉病的抗性。Wang 等［49］敲除小麦子粒重基因TaGW2，使编辑后的小麦突变体子粒大小和千粒重显著增加。Do 等［50］利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术同时靶向敲除调控大豆油酸转化为亚油酸的关键酶基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B，双突变体植株的油酸含量显著增加至80%以上，而亚油酸含量下降至1.3%～1.7%，并在下一代就创造了无转基因高油酸大豆纯合品种。Wang等［51］利用CRISPR/Cas9 技术精确编辑大豆GmLOX基因，创制了无腥味大豆。Li等［52］靶向敲除大豆GmNAC06基因，其突变体在盐胁迫过程中耐盐性显著增强。

除此以外，其他大田作物也成功实现了CRISPR/Cas9 技术的应用，如马铃薯［53］、大麦［54］、棉花［55］等。CRISPR/Cas9 技术在基因水平上对大田作物进行靶基因精准高效编辑，加速了具有优异性状新品种的产生。

2.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术在林木中的应用

林木具有世代周期长、遗传背景复杂等特点，遗传育种与性状改良十分缓慢［35］。CRISPR/Cas9 基因编辑技术的出现，极大地改善了这一现状。杨树是木本植物遗传研究的模式树种，也是木本植物中CRISPR/Cas9 基因编辑技术发展最为迅速的树种。2015年，Fan等［56］利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除毛白杨中八氢番茄红素脱氢酶基因PtPDS，导致杨树白化表型；同年，Zhou 等［57］成功编辑种间杂种银灰杨中4-香豆酸辅酶A 连接酶基因Ptr4CL1和Ptr4CL2，获得茎秆呈红褐色的突变体材料。Muhr等［58］利用CRISPR/Cas9 技术成功敲除杨树中的基因PcBRC1-1和PcBRC2-1，敲除株系的分支数目均显著增加。Wan 等［59］通过CRISPR/Cas9 技术敲除毛白杨中花青素和原花色素的生物合成负调控基因PtrMYB57后，产生的毛白杨突变体中观察到高花青素和原花色素表型。

除杨树以外，CRISPR/Cas9 技术在其他林木中的研究也越来越多。多年生木本植物的童期较长，需要多年栽培才能开花。Charrier 等［60］靶向敲除苹果和梨的顶花基因MdTFL1.1和PcTFL1.1，两种敲除株系均有提前开花的表型。Varkonyi-Gasic 等［61］利用CRISPR/Cas9 技术定向突变猕猴成花负调控因子AcCEN和AcCEN4，AcCEN或AcCEN4的突变体均有提前开花的表型。这些研究进展为缩短多年生木本植物的童期，提高杂交育种效率，提供了新的思路和方法。Ren等［62］将CRISPR/Cas9技术引入到葡萄研究中，靶向敲除葡萄细胞中酒石酸合成关键酶IdnDH，显著降低了突变体中酒石酸的含量，证实了该技术应用于葡萄基因组修改的可行性。Peng等［63］通过CRISPR/cas9 技术靶向修饰柑橘溃疡病易感基因CsLOB1启动子区域的效应子结合元件（EBEPthA4），提高了柑橘的抗病能力。Gomez 等［64］靶向敲除木薯的两个转录起始因子基因ManCBP-1和ManCBP-2，抑制了由褐斑条纹病毒引起的木薯褐纹病的病害症状。

以上CRISPR/Cas9 技术在各林木植物上的成功应用，为CRISPR/Cas9 系统应用于桑树提供了理论基础和技术方法。

3 CRISPR/Cas9 基因编辑技术在桑树中的应用展望

目前桑树主要采用传统育种和分子标记辅助育种来培育更好的品种，但这些方法需要较长的时间，育种进程十分缓慢。随着传统基因工程技术被应用于桑树育种研究，基因工程育种虽然取得了一定的研究进展，丰富了育种手段，但是桑树育种效率并没有显著的提高。CRISPR/Cas9 技术的出现为桑树育种工作带来了新的技术方法，其简便高效已在多种植物中得到证实，该技术应用在桑树研究中将是一大技术革新。

3.1 传统基因工程在桑树育种的应用

桑树的基因工程研究由来已久，不断突破桑树遗传转化和组织再生等技术难题［65-68］。通过基因枪法、根癌农杆菌介导法、电穿孔法和活体转化法等多种技术对桑树进行外源基因的遗传转化已经有报道［66，67，69-71］。2003 年，Bhatnagar 等［72］在桑 树品种 印度桑K2 中发展了一种高效、可重复、转化效率高的桑树转基因技术。近年来，该技术得到不断的改进发展，用子叶和下胚轴等外植体转化印度桑K2，转化效率可达20%～60%。

经过多年的发展，转基因技术在桑树育种中的研究有较大的进展［73］。谈建中等［74］为了获得高蛋白桑树品种，将大豆球蛋白A1aB1b基因转入桑树品种新之一濑，通过分子检测结果显示成功获得了转基因桑树植株。管志文等［75］将柞蚕抗菌肽D 基因成功转入桑树品种新之一濑，获得的转基因桑苗对桑树青枯病的抗性显著增强。王勇等［76］将抗菌肽shivaA基因转入桑树品种丰驰桑，成功获得转基因植株，经抗病性测定，证明转基因植株对顺德型桑树青枯病菌株具有不同程度的抗病性。Lal 等［77］和Checker 等［78］将不同启动子驱动的大麦胚胎晚期丰度基因Hva1基因导入印度桑K2 中，在组成启动子actin1的驱动下表达Hva1基因，显著增强了桑树的耐旱和耐盐性；而大麦Hva1基因在胁迫诱导启动子rd29A的控制下，可以有效阻止桑树在非胁迫条件下的生长迟缓，并赋予转基因桑树耐寒性。Das等［79］将由CaMV35S启动子和rd29A启动子分别驱动的烟草胁迫响应基因Osmotin转入到印度桑K2 中，由CaMV35S启动子驱动的Osmotin基因，赋予转基因桑树对非生物胁迫和生物胁迫的耐受性。当Osmotin基因由rd29A启动子驱动表达时，转基因桑树则表现出耐旱和耐盐性。Sajeevan 等［80］将拟南芥蜡质相关基因AtSHN1转入到印度桑M5 中，转基因桑叶表现出深绿色光泽，表面蜡质含量增加，相比受体桑树叶片保水能力更好。Saeed 等［81］将水稻Osbch1转入到印度桑M5 中，转基因植株表现出更高水平的类胡萝卜素。

桑树的遗传转化体系已趋于成熟，相关研究也越来越多。目前桑树转基因的研究多为外源基因转入桑树中，以期获得优良性状的桑树新品种，但是对桑树基因的基础研究较少，桑树转基因可操作的目标基因有限。人们对转基因技术有抵触情绪阻碍了转基因品种的应用与推广，因此桑树转基因的研究成果多为实验室研究，未能进行田间应用。桑树是多年生木本植物，桑树转基因研究多为目的基因在桑树中的过量表达。随着桑树的生长发育，转入目的基因的表达丰度很难维持高水平，从而造成目的性状逐渐消失。

综上所述，传统基因工程本身的局限性与桑树的特殊性导致传统基因工程桑树育种研究的发展滞缓，很难得到广泛应用。CRISPR/Cas9 基因编辑技术的出现并不断地成功应用于多种植物中，利用该技术进行作物育种研究的优势已经显而易见。目前，CRISPR/Cas9 技术在桑树育种中的研究还未见报道，但是随着桑树基因组信息的完善和桑树基因研究的开展，CRISPR/Cas9 技术将在桑树的基因功能研究和遗传育种方面发挥重要作用。

3.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术应用于桑树的优势分析

CRISPR/Cas9 基因编辑技术是继转基因技术后的一项新的技术，在未来桑树遗传育种和性状改良方面有巨大的潜力。该技术能够对桑树基因定向精确编辑，消除不需要的性状或者在优质品种中添加所需要的性状，大大提高遗传改良效率［82］。本文探讨CRISPR/Cas9 技术应用于桑树育种中的可能性及优势，以期为将来的桑树遗传育种和基因功能研究提供新的思路和方法。

1）CRISPR/Cas9 技术的应用依赖于桑树的遗传转化和组织再生等技术。随着转基因技术在桑树育种和基因功能研究工作的不断开展，桑树的遗传转化和组织再生等技术趋于成熟，为CRISPR/Cas9 技术在桑树中应用提供了技术条件。

2）在桑树的基础研究中，CRISPR/Cas9 技术更加简便高效，并且编辑靶基因后的表型性状更加稳定，相比转基因技术没有其他外源序列的干扰，有利于桑树基因的功能研究。

3）桑树的幼年期较长，需要3 年以上才能开花结果，不利于传统桑树育种工作。利用CRISPR/Cas9技术成功编辑的桑树，只需一个世代或者可直接应用于生产实践，试验研究到田间应用的时间大幅度缩减。相比于转基因技术，CRISPR/Cas9 技术是在桑树基因组层面进行定点编辑，没有基因过量表达和转入位点位置效应等情况的干扰，目标性状稳定可靠，随着桑树的生长发育不会有太大的变化，更适合于桑树的遗传育种和性状改良。

4）CRISPR/Cas9 技术在桑树中的应用范围将极为广泛，例如蚕桑的桑叶增产、药桑的药物活性分子的含量富集、饲料桑的桑叶蛋白质含量的增加、食用桑的桑叶营养成分的富集和食用口感改善、生态桑的生物胁迫和非生物胁迫的抗性等，都将有其用武之地。

综上所述，新技术CRISPR/Cas9基因编辑系统相比较传统基因工程技术更适合于桑树的育种研究，具有很大的优势和应用前景。但是，随着CRISPR/Cas9技术的广泛应用，其基因编辑的局限性也逐渐显现，例如脱靶效应和编辑位点的限制等。因此建立起高效的sgRNA 数据库，开展广泛的基因功能研究，开发新的基因编辑技术将会是CRISPR/Cas9 基因编辑技术应用于桑树研究后的重要工作。随着桑树基因组学、转录组学和代谢组学的研究工作不断开展和新的基因编辑技术CRISPR/Cpf1、CRISPR/Cas12b 和CRISPR/Cas13a的出现，基因编辑技术应用于桑树的障碍不断被清除，未来基因编辑技术将会和传统育种方法、转基因技术一起在桑树育种工作中发挥作用，为桑树多元化种质创制做出巨大贡献。