液相色谱法测定土壤中15种醛酮类化合物

冯小康 朱 强 郑亚丽

(苏州国环环境检测有限公司，江苏 苏州 215000)

醛酮类化合物根据与羰基相连的烃基，可分为脂肪族醛酮，芳香族醛酮，饱和醛酮和不饱和醛酮[1],广泛应用于有机合成、化工、合成纤维、染料、农药等行业[2]。迄今为止，还没有发现环境介质中大量产生醛酮类污染物的天然来源，土壤和沉积物中的醛酮类污染物主要是人类生产活动造成的。此外，大气中的甲醛、乙醛、丙酮、苯甲醛等化合物也可伴随干、湿沉降进入土壤，也是土壤醛酮类化合物重要的污染来源之一[3]。醛酮类污染物具有生态毒性，对人类、动物、植物具有很大危害，是环境中主要污染物之一[4]。

国内外对环境空气中的醛酮类化合物相关研究较多，土壤方面的研究较少，气相色谱法和液相色谱法为较常用的检测方法[5-6]。但由于2，4—二硝基苯肼(DNPH)衍生物较低的挥发性和较差的热稳定性，气相色谱法一直没能得到广泛应用[7]。目前国内已出台了液相色谱法测定土壤中醛酮类化合物的标准，本研究测定方法参照HJ 997—2018，并在此基础上进行优化探讨。崔连喜，李利荣等已经深入探讨了液液萃取溶剂的选择和液液萃取方式的对比[8]，所以本文在对比液液萃取和固相萃取两种方式的基础上，又着重探讨了固相萃取条件的对比，以此丰富土壤中醛酮类检测方法的研究。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent LC 1260液相色谱仪，配备紫外检测器(VWD)，色谱柱型号ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6×250 mm, 4 μm；SPE1000-4全自动固相萃取仪(北京莱伯泰科仪器公司)，C18柱固相萃取柱；恒温振荡器(科析仪器公司，THZ-82)；LabTech浓缩仪(MultiVap-10)；探头式超声仪(上海生析超声公司，FS-450N)；超声清洗器(昆山超声仪器公司，KQ-600V)。

15种醛酮类混合标准溶液(上海安谱)：1 000 mg·L-1，15种醛酮类-2,4-二硝基苯肼混合标准溶液(上海安谱)：1 000 mg·L-1。

醋酸-醋酸钠提取剂：称取5.3 g醋酸钠，用水溶解后加入2.0 mL冰醋酸，用水稀释定容至1 L。

缓冲溶液：称取84.0 g柠檬酸和29.4 g柠檬酸钠，用水溶解定容至500 mL， pH≈3。

DNPH衍生剂：称取3.00 g DNPH于乙腈中，用乙腈溶解定容至1 L。

1.2 仪器条件

柱温35 ℃保持34 min，流动相为60%乙腈+40%水等度洗脱，流速1.0 mL/min，紫外检测器波长360 nm，进样量10.0 μL。

1.3 方法原理

醛、酮的氧原子可以与水形成氢键，因此低级醛、酮可以与水混溶[1]。根据其性质，土壤中醛酮类化合物用醋酸-醋酸钠溶液振荡提取，提取液中醛、酮类化合物在一定温度和pH下与DNPH发生衍生化反应，生成稳定的腙类化合物，经萃取浓缩后，用高效液相色谱分离，紫外检测器检测，以保留时间定性，外标法定量。

1.4 试验方法

称取10.00 g样品于250 mL提取瓶中，加入200 mL 提取剂密封，在振荡器中振荡不少于18 h，用玻璃纤维滤膜过滤，收集提取液，取100 mL提取液于平底烧瓶中，加入4 mL缓冲溶液、6 mL衍生剂，置于超声清洗器中衍生，40 ℃超声30 min。向衍生后的溶液中加入10 mL氯化钠溶液(ρ=0.365 g/mL)并转移至C18固相萃取柱萃取，用乙腈洗脱，收集洗脱液并定容至10 mL，按上述条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

本文考察了ZORBAX SB-C18(4.6×250 nm,5 μm)，ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm, 4 μm)，ZORBAX ODS (4.6×250 mm,5 μm)三种型号液相色谱柱对15种醛酮类-DNPH的分离效果，结果如图1。

(1) ZORBAX SB-C18色谱柱

(2) ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱

(3)ZORBAX ODS色谱柱

由图1可知，使用ZORBAX SB-C18色谱柱，大多数的目标化合物能够实现分离、有较好的响应值和峰型，但是间-甲基苯甲醛和对-甲基苯甲醛色谱峰完全重合。ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱可以分离15种醛酮类化合物，并且有良好的响应值和峰型；虽然该色谱柱对间-甲基苯甲醛和对-甲基苯甲醛的分离度不佳，但是可以通过改变积分参数实现单独定量，本研究为了便于统计将两者合并计算。ZORBAX ODS色谱柱虽然也有同样的效果，但是其出峰时间太短，土壤的基质干扰通常很大，不利于目标物的定性，最终本试验选择ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱。

2.2 提取方式的选择

加入一定量的醛酮类混合标准溶液至空白土壤中，分别采用振荡提取、探头式超声提取、超声清洗器提取三种方式进行提取。其中振荡提取和清洗器提取按照上述实验步骤进行；探头式超声为防止目标物挥发损失，将提取剂和衍生剂一起加入到加标样品中，在提取的同时进行衍生化反应[3]。结果见图2。

从图2可以看出，探头式提取方式回收率略高于超声清洗剂提取，振荡提取时，15种醛酮类化合物的回收率大部分>70%，明显高于两种超声提取的回收率，因此本研究选择振荡提取的方式提取土壤中醛酮类化合物。

图2 不同提取方式下醛酮类化合物的回收率Fig. 2 Recovery of aldehydes and ketones under different extraction methods

2.3 萃取方式的对比

本节对比了液液萃取和固相萃取两种方式的回收率。同样，制备已知量的空白土壤加标样品，按照上述试验方法进行固相萃取。液液萃取方法为向衍生后的提取液中加入1.5 g NaCl，分别用15 mL和10 mL 二氯甲烷分两次萃取，萃取液经无水硫酸钠脱水，氮吹浓缩近干，更换溶剂为乙腈，用乙腈准确定容至10 mL，混匀待测，结果见图3。

图3 不同萃取方式下醛酮类化合物的回收率Fig. 3 Recovery of aldehydes and ketones under different extraction methods

从图3中可以看出，固相萃取方法的回收率大部分物质略高于液液萃取，除甲醛外其他相差不超过10%，两种方式都可以得到较好的回收效果，因此两种萃取方式都可以用来测定土壤中醛酮类化合物，本试验选择固相萃取方式。

2.4 基质的影响

分别称取10.00 g石英砂、砂土和壤土，制备醛酮类混标加标量为1.0 μg·kg-1的三种加标样品，考察了样品基质对醛酮类回收率的影响，结果见图4。

从图4可以看出，三种基质回收率石英砂>砂土>壤土，说明基质对回收率有一定的影响，但是本文只讨论了三种基质对回收率的影响，具体如何影响、是否其他类型固体基质也有影响还需要大量的实验数据佐证。

图4 基质对回收率的影响Fig. 4 The effect of matrix on recovery

2.5 固相萃取条件的优化

2.5.1 萃取次数

将两组加标量相同的衍生后的提取液进行固相萃取。其中一组转移至C18固相萃取柱萃取，用乙腈洗脱，收集洗脱液并定容至10 mL；另一组同样步骤萃取，收集洗脱液，再重复一次萃取和洗脱，合并2次萃取液，浓缩至10 mL以下，定容至10 mL。测定结果如图5。

图5 萃取次数对回收率的影响Fig. 5 The effect of extraction times on recovery

结果表明萃取次数对土壤中醛酮类化合物的回收率没有太大影响，说明萃取1次可以满足回收率的要求，所以本试验选择固相萃取1次。但是对于高浓度的样品，萃取柱吸附剂可能达到饱和，可适当增加一次萃取提高样品回收率。

2.5.2 洗脱溶剂

固相萃取的原理是利用选择性吸附和选择性洗脱的方式对目标物进行富集、分离和净化的过程。本文选择乙腈和二氯甲烷两种溶剂进行洗脱，结果如图6。

图6 不同洗脱溶剂对回收率的影响Fig. 6 The influence of different elution solvents on recovery

从结果可以看出，乙腈和二氯甲烷淋洗萃取柱对结果的影响差的不是很大，醛酮类极性相对弱些的几种物质的，用二氯甲烷淋洗稍好于乙腈，这可能由于二氯甲烷的极性小于乙腈，根据“相似相溶”原理对部分物质淋洗更充分。实际试验过程中，乙腈淋洗结果回收率更稳定，并且不需要转换溶剂，综合上述结论，本试验选择乙腈作为淋洗溶剂。

2.6 标准曲线与检出限

分别加入0.00、2.00、4.00、6.00、30.0、60.0、100 μL 的醛酮类-DNPH标准溶液，用乙腈稀释至1 mL，标准系列溶液浓度分别为：0.00、0.03、0.06、0.09、0.45、0.90、1.50 μg·mL-1。按照仪器条件进样分析，以标准系列溶液中目标化合物浓度为横坐标，以其对应峰面积为纵坐标，建立标准曲线，线性回归方程如表1。

对方法检出浓度的3～5倍浓度的样品连续测定10次，根据标准偏差S计算检出限。计算公式为MDL=t(n-1,0.99)×S，式中t(9,0.99)=2.821，结果见表1。

表1 醛、酮类标准曲线和检出限

2.7 精密度与准确度试验

按照上述试验方法对3个加标浓度分别为0.20 mg·kg-1、0.50 mg·kg-1、2.00 mg·kg-1的空白土壤样品进行6次重复测定，计算精密度和准确度，结果见表2。

表2 精密度和准确度试验结果

由表2可知，丙酮的回收率范围40.8%～56.5%，醛类化合物回收率范围63.0%～86.5%，相对标准偏差6.4%～19%。丙酮回收率偏低是由于丙酮水溶性强，衍生化效率稍低[3]。

2.8 实际样品分析

采集某化工企业土壤样品，按照试验方法进行测定，结果检测出甲醛浓度1.56 mg·kg-1、乙醛浓度0.68 mg·kg-1，其他物质未检出。

本文采用溶剂提取-DNHP衍生-C18固相萃取-液相色谱法测定土壤种的15种醛酮类化合物，并讨论了不同色谱柱、不同提取方式和萃取方式的对比以及基质对目标化合物回收率的影响，优化了固相萃取条件。此方法抗干扰强、回收率高、检出限低、简洁高效，方法线性范围、精密度准确度结果满意。