子宫内膜癌分子分型的研究进展

支文雪，刘红刚

子宫内膜癌(endometrial carcinoma, EC)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤[1]。目前组织学分型和分级是EC分类的基石[2]，是临床制定治疗方案的重要参考指标。然而由于EC异质性大，传统组织学分型和分级可重复性低，各型之间组织学特点常存在重叠，有时不能完全满足临床对于预测预后和精准治疗的需求。因此，寻求一种重复性更高、对治疗更有指导意义的分类方法成为近年研究的热点。2013年美国癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)研究将EC分为POLE超突变型、微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)高突变型、低拷贝数型(copy number low, CNL)/微卫星稳定型(microsatellite stable, MSS)和高拷贝数型(copy number high, CNH)/类浆液样型[3]，其中POLE超突变型预后最好，高拷贝数型预后最差。本文就近年来各分子亚型的研究进展进行综述，以期将传统病理学诊断与分子分型相结合，为更精准临床诊疗和管理提供信息。

1 TCGA分子分型及临床病理特征

1.1 POLE超突变型POLE是DNA聚合酶ε(DNA polymerase epsilon)的一个催化亚基，具有DNA链延长和延长中校正复制错误这两种催化活性，该基因发生突变时，错配碱基不能被识别及修复，从而使基因组突变数量异常增高导致肿瘤发生。POLE超突变型(或称POLE突变型)所占比例最少，约占全部内膜癌的10%，包括6%的低级别(FIGO G1及G2)子宫内膜样癌(endometrial endometrioid carcinoma, EEC)和15%～22%的高级别(FIGO G3)EEC。该亚型的主要特点为体细胞超高突变负荷(232×10-6突变/Mb)、POLE外切酶结构域(exonuclease domain mutations, EDM)突变、高碱基替换率(C→A)和MSS，在4个分子亚型中预后最好。其特征性的突变谱包括PTEN(94%)、PIK3CA(71%)、PIK3R1(65%)、FBXW7(82%)、ARID1A(76%)、KRAS(53%)和ARID5B(47%)，主要突变位点为P286R、V411L、S297F、A456P和S459F[3]。

典型的POLE超突变型EC临床病理特征表现为患者年龄较轻、分期较早，形态学具有异质性，多为高级别EEC以及伴有显著的肿瘤内淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)(≥40个/10 HPF)或肿瘤周围淋巴细胞浸润[3-4]。POLE超突变型EC大部分是MSS(65%)，但是35%的肿瘤同时携带了TP53基因突变，这提示在检测过程中有可能将该预后极好的分子亚型错误分类为预后最差的CNH/类浆液样型。POLE超突变型在透明细胞癌、未分化癌及癌肉瘤中也有报道[5-7]。随后的多项回顾性研究也证实了具有高级别组织学形态特点的POLE超突变型患者的预后良好[8-10]。portec-2临床试验中纳入了427例高中危风险组EC患者，其中POLE超突变型患者的10年癌症相关生存率为100%，而p53突变组为62.3%(P<0.001)[11]。研究发现其预后良好可能并非由于其对术后治疗更敏感，而是此亚型本身生物学行为良好。POLE突变的胚胎干细胞并没有表现出对放疗和化疗更高的敏感性，却表现出对核苷酸类似物阿糖胞苷和氟达拉滨更高的敏感性，因而提示对于进展期的POLE超突变型患者有可能从核苷酸类似物治疗中获益[12]。基于上述研究成果，许多研究者认为POLE突变可作为一项提示EC预后极好的预测指标，从而引发对于该型患者治疗的思考，尤其是对于有生育要求的年轻女性是否可以采取更为保守的治疗。然而国内近期一项收集228例EEC的回顾性研究却没有得出一致的结论，研究者发现各分子亚型间临床病理参数差异均无统计学意义[13]。国内外研究结果之间的差异可能是由于遗传背景差异和入选病例组织学亚型及病例量的偏倚，确切数据尚需更多中心和更多病例量的确认。同时高级别EC组织学分型较困难，一些POLE超突变型可能会被错误分类，而分子分型整合入组织学分类中有助于改善这些问题，能更好地鉴定FIGO G3级EEC和浆液性癌，从而更好地为临床评估预后和制定治疗方案提供更为精准的信息。

1.2 MSI高突变型MSI是由于DNA错配修复基因(mismatch repair, MMR)突变导致DNA碱基错配校正异常，从而引起具有微卫星重复序列的基因发生改变。TCGA分型中采用的MSI检测方法是应用PCR方法在美国国立癌症研究所推荐的5个核苷酸位点(BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250)基础上增加了2个单核苷酸位点(BAT40和TGFR-Ⅱ)，将EC分为三型：如果有≥3个(大于40%)微卫星位点出现不稳定，为微卫星高度不稳定型(MSI-H)；如果1～2个(小于40%)微卫星位点出现不稳定，为微卫星低度不稳定型(MSI-L)；0个位点检测到不稳定，则为MSS型[14]。该亚型有较高突变负荷(18×10-6突变/Mb)，突变频率约为MSS型的10倍，并表现出频繁的KRAS突变，较少发生FBXW7、CTNNB1、PPP2R1A和TP53突变。MSI高突变型占所有EC的25%～30%，且多数是由于MLH1启动子甲基化形成表观遗传学沉默的散发性EC，遗传性的林奇综合征仅占所有EC的2%～3%[15]。PCR法检测MSI或免疫组化检测MMR蛋白(MLH1、PMS2、MSH2及MSH6)表达状态作为林奇综合征的筛查手段已在临床上达到广泛共识，但在临床实践中却有较大差异。

组织形态学上，MSI高突变型EC与POLE超突变型EC较为相似，多为高级别EEC以及伴有显著的肿瘤内淋巴细胞浸润，然而两型患者的预后却有所不同。McMeekin等[16]在一项纳入1 024例EEC的研究中发现尽管MMR缺陷型(deficient MMR, dMMR)EEC与一些不良预后因素[如FIGO分期晚、肿瘤细胞高级别和淋巴脉管间隙受累(LVSI)]相关，但其预后与MMR完整型EEC并无显著差异，这提示dMMR-EEC可能诱发了较强的抗肿瘤免疫应答。广泛LVSI虽然可以在各分子亚型中出现，但其在dMMR-EC中的发生率更高(P=0.002)，从而显著提高肿瘤的复发风险[17]，这也解释了为何分期较晚的肿瘤大部分为dMMR亚型。2017年5月23日FDA首次直接批准Pembrolizumab(Keynote)治疗具有MSI-H/dMMR分子表型的实体肿瘤。研究者发现使用Pembrolizumab治疗的患者中，dMMR者表现出较MMR完整者更高的免疫相关反应率和免疫相关无进展生存率[18]。

1.3 CNL/MSS型体细胞拷贝数变异(somatic copy number alterations, SCNA)被定义为基因组部分重复的现象，TCGA根据SCNA的特点将EC分为CNL和CNH/类浆液性肿瘤型。CNL型即MSS型，该亚型突变负荷较低(2.9×10-6突变/Mb)，常见突变为PTEN(77%)、CTNNB1(52%)、PIK3CA)(53%)、PIK3R1(33%)和ARID1A(42%)，其中CTNNB1是唯一一个突变率高于MSI高突变型的基因。CTNNB1突变发生在19%～37%的EEC中，在MSS-EEC(24%～52%)中较MSI(11%～20%)更常见。CNL型代表了大部分低级别(G1和G2)EEC，该型在所有亚型中具有中等预后，然而其中一小部分预后却较差。Kurnit等[19]研究发现在预后差的Ⅰ+Ⅱ期低级别EEC中，CTNNB1和TP53突变是无复发率差的独立预测因素，84%的CTNNB1突变肿瘤免疫组化染色显示β-catenin(CTNNB1编码蛋白产物)核染色阳性。该研究结果提示对于CTNNB1突变的女性EC患者可能需要更为积极地治疗。该亚型Wnt信号通路基因(CTNNB1、KRAS和SOX17)存在频繁突变，Wnt信号通路异常激活促进细胞增殖及肿瘤进展，有效的Wnt通路抑制剂可能使该亚型患者受益。KRAS不仅在丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中起作用，而且在Wnt信号通路中也起作用。目前，正在研究利用MAPK通路中重要的蛋白激酶MEK抑制剂的靶向治疗，这可能对KRAS突变的肿瘤有效。一项临床Ⅱ期试验结果显示，MEK抑制剂selumetinib单药治疗复发或持续性EC的耐受性良好，但疗效有限(6个月无瘤生存率仅12%)[20]。单一MAPK途径的改变(Ras/Raf突变)可能不足以引起临床效应，未来需进一步研究异常Wnt/CTNNB1信号通路传导的生物学机制。

1.4 CNH/类浆液性型与CNL/MSS型相反，CNH/类浆液性型突变负荷低(2.3×10-6突变/Mb)，具有广泛的SCNA，常见突变依次为TP53(92%)、PIK3CA(47%)和PPP2R1A(22%)突变，而PTEN和KRAS基因突变罕见[3]。TCGA数据库显示此型包含几乎所有浆液性癌(97.7%)和25%的G3-EEC，预后最差。其中浆液性癌与G3-EEC的组织学形态和免疫表型特征可能存在较大的重叠，导致高级别EC组织学分型诊断重复性差。23%～25%的CNH型肿瘤中存在MYC、ERBB2(HER-2)和CCNE1(Cyclin E1)基因的局部扩增，因此推测HER-2靶向抑制剂可能对HER-2过表达的该亚型肿瘤具有潜在治疗作用。近期一项Ⅱ期临床试验发现在晚期复发的HER-2阳性浆液性癌中，曲妥珠单抗与卡铂-紫杉醇联合用药组较单纯化疗组患者的无进展生存期增加[21]。

2 分子分型优化检测方法

TCGA分子分型测序技术虽然在评估预后、指导个体化治疗方面具有优势，然而测序技术费用高昂且操作复杂，临床应用性差。因而近年来，研究者们致力于探索方法简便、临床实用性强、可以在病理科常规开展的分子分型方法。

2015年Stelloo等[10]结合p53免疫组化结果(免疫组化不确定者行Sanger测序)评估p53状态，通过Promega MSI分析系统联合MLH1免疫组化检测评估MSI状态(对于MSI阳性但MLH1蛋白无缺失的肿瘤继续行其他三项错配修复蛋白MSH2、MSH6和PMS2免疫组化检测)，最后通过Sanger测序鉴定POLE 9～13号外显子的热点突变，最终将来自多中心的116例高危组EC分为4个分子分型亚组：p53突变组(39例，34%)、MSI组(19例，16%)、POLE突变组(14例，12%)和无特定分子谱组(no specific molecular profile, NSMP)(44例，38%)。生存分析结果显示，POLE突变组和MSI组的患者肿瘤复发和远处转移率均明显低于p53突变组和NSMP组。该改良方法最终得到的分组虽不能完全等同于TCGA分型，但可观察到与TCGA相似的4条生存曲线。此研究指出高级别EEC间异质性很大，不可单纯用组织学进行简单分类，并采用p53突变组和NSMP组重新定义了既往以组织病理学为标准的高危风险组患者，在评估患者预后、弥补治疗不足、减少过度治疗上具有重要意义。然而这种方法并未对无法进行分子检测的肿瘤和包含1种以上分子改变的肿瘤(2%～3%)明确分型。

2015年Talhouk等[22]进一步简化了上述检测方法和步骤，发明了ProMisE(Proactive Molecular Risk Classifier for Endometrial Cancer)模型，该改良方法首先进行MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)免疫组化检测确定dMMR组，进而通过测序鉴定POLE EDM突变情况确定POLE突变组，第三步采用p53免疫组化法代替拷贝数状态检测确定p53突变组与p53野生组，来重现TCGA基因分组。其中p53突变组中高级别、进展期、非EEC所占比例最高，而POLE突变组中的肿瘤虽富于侵袭性(大部分为G3级EEC，并常伴有深肌层浸润和LVSI)，但预后较好。2017年Talhouk等[8]继续收集319例EC患者，证实ProMisE模型分组在总体生存、疾病特异生存和无进展生存期中差异有显著性(P<0.001)，与之相对应的现在临床上广泛应用的基于术后病理特点的欧洲肿瘤内科学会(European Society of Medical Oncology, ESMO)风险评估系统中所定义的低危组和中危组预后并无明显差异，从而确定该模型分组适用于临床，并可提供独立的预后信息。该分型方法首先对全部病例进行MMR免疫组化检测，可以及时对林奇综合征疑似患者进行分流；并且在福尔马林固定石蜡包埋组织中即可进行，对样本要求较低，可以用于病理科日常工作实践。2018年Kommoss等[23]进一步验证了ProMisE分类模型的意义，并且证实了术前诊刮标本和术后标本中ProMisE结果高度一致(约为91%)。这意味着术前应用ProMisE分型可较准确地进行分子分型并指导后续辅助治疗，并为有生育要求的年轻女性提供更多的选择机会，当然，这一分型需要更多的前瞻性研究来进行临床评估。

值得注意的是，各组肿瘤之间的分子改变有时并非截然分开，比如POLE超突变型也可以同时携带TP53基因突变。ProMisE分型检测方法如果不是序惯进行而是平行进行分类时，则对同时包含多个基因组突变(POLE突变、dMMR或TP53突变)的肿瘤无法进行准确分类；同时也无法检测出CNL组中的显著异质性。因此，Rajmohan等[24]建议在病理科实际检测工作中对ProMisE分型流程略作改动，即先进行POLE测序分组，再行MMR免疫组化检测。这一检测流程也是2020年第1版NCCN指南所推荐的流程。

3 结语

EC的发生、发展是由多种信号转导通路及基因异常的相互作用，其在组织形态及分子水平上具有较大异质性，目前单纯基于组织病理学分类或基因改变的分子分型均不能很好地全面反映肿瘤的生物学行为及患者预后。因此，未来临床病理特征与分子分型信息的整合可能为内膜癌的诊断及预后评估提供了一个更合适的方式，这不仅有助于将G3-EEC中预后良好组与预后不良组(POLE高突变和CNH亚型)区分开来，还能将浆液性癌与分型难定的类似于浆液性癌的低级别EEC(如POLE高突变型及dMMR型)区别开来。然而对于TCGA分子分型的研究多是回顾性研究，缺乏前瞻性的临床试验验证，所以4个亚型与临床病理特征和生物学行为之间的关系需要进一步研究。此外，POLE突变检测也需要临床医师的认可和更多医保政策的支持。现今仍然有很多问题需要解决，比如是否有必要将p53突变组/CNH组中的G3-EEC、浆液性癌和透明细胞癌鉴别诊断出来，以及ProMisE模型在术前活检标本的应用能否真正将患者分流至不同分期手术方式等均有待深入探究。