呼吸道病原核酸检测法在小儿肺炎链球菌感染中的临床应用

贾晓芸 陈宏君 吴林媛

肺炎链球菌（SP）为常见病原菌，全世界每年由于肺炎链球菌感染导致的死亡人数约为120 万［1］。链球菌属于苛养型细菌，对培养的条件要求较苛刻，且传统分离培养的时间较长，不能帮助临床医师及早识别致病原，易延误患儿的病情［2］。因此，临床上需要能高效、快速、精准检测呼吸道病原菌的方法，为临床医生提供更好的早期诊断依据。本文探讨呼吸道病原菌核酸检测在小儿SP 感染中的临床效果，现报告如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 （1）纳入标准：①肺炎的诊断标准按照2013 年儿童社区获得性肺炎管理指南［3］；②年龄在1 月至1 岁；③加入本研究前未接受抗生素治疗；④家属知情并签署知情同意书。（2）排除标准：①合并其他系统病变；②加入本研究前已使用抗生素治疗。从2019 年12 月-2020 年12 月广东省珠海市妇幼保健院儿呼吸科收治的符合研究要求的下呼吸道感染患儿中随机抽取350 例，同时采集痰标本行痰培养（A 组）和采集咽拭子行呼吸道病原学核酸检测（B 组）。本研究经医院伦理委员会同意。

1.2 方法 （1）A 组：在患儿使用抗生素前经鼻导管吸痰采集痰液，留取痰标本时严格执行无菌操作，采集标本量1 ml 以上，使用专用的痰培养杯，在半小时内送检。检验科微生物室按常规操作接种在培养平板内，对其进行后续处理。（2）B 组：采集咽拭子前半小时禁止喝水，采样者用压舌板固定舌头，用棉拭子越过舌根到咽后壁、扁桃体隐窝及侧壁，擦拭3 次，把拭子插回采样装置中。标本送广州达安临床检验中心，采用KingFisher 全自动核酸提取仪和广州美基生物科技有限公司的病毒总核酸提取试剂盒，按照试剂盒说明书和仪器操作手册，提取标本中病毒总核酸。利用多重PCR 和Luminex 悬浮态芯片技术进行呼吸道病原体核酸检测，可同时检测甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、副流感病毒（PIV）、鼻病毒（HRV）、腺病毒（ADV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人偏肺病毒（hMPV）、博卡病毒（BoV）、巨细胞病毒（CMV）、流感嗜血杆菌（HI）、肺炎链球菌（SP）、卡他莫拉菌（MC）、肺炎支原体（MP）和百日咳杆菌（BP）等14 种呼吸道主要病原体。检测仪器为Luminex MAGPIX 相悬浮芯片系统，按检测试剂参数根据cutoff 值进行结果判读。

1.3 观察指标 两组检查方法中SP 的阳性检出率、检测时间及费用。

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0 统计学软件处理数据，组间均数比较采用t检验，率的比较使用卡方检验，以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组检出病原体比较 A 组SP 阳性28 例，阳性率

8.0%，B 组SP 阳性55 例，阳性率15.7%，B 组SP 阳性率明显高于A组，P<0.05。此外，B组还检测出其他病原体，其中病毒158 例（巨细胞病毒52 例、呼吸道合胞病毒32 例、鼻病毒22 例、副流感病毒22 例、甲型流感病毒10 例、乙型流感病毒8 例、博卡病毒6 例、腺病毒3 例、人偏肺病毒3 例），肺炎支原体32 例，其他细菌30 例（流感嗜血杆菌14 例、卡他莫拉菌14 例、百日咳杆菌2 例），其中混合感染69 例。

2.2 两组检测时间及费用比较 A 组痰培养的检测结果时间为（76.8±48.2）h，B 组核酸检测结果时间（5.6±2.5）h，A 组病原体检测时间明显长于B 组，P<0.05。但B 组检测费用456 元∕次明显高于A 组的69 元∕次，P<0.05。

3 讨 论

3.1 小儿SP 肺炎特点 小儿SP 肺炎是由SP 感染引起的急性肺部炎症，常引起大叶性或节段性肺部炎症，其中原发性SP肺炎多见于3岁以上小儿，因该年龄组机体防御能力逐渐成熟［4］。继发性SP肺炎多见于婴幼儿，常继发于病毒性肺炎［5］。因为婴幼儿时期的免疫功能尚未成熟，病菌沿支气管播散形成以小气道周围实变为特征的病变即支气管肺炎，为儿童SP 肺炎最常见的病理类型。本病一年四季均可发病，但以冬春季、气候骤变时多见。SP 肺炎的病变若局限于一个肺叶或一个肺段而不扩散为大叶性肺炎。年幼儿临床表现常不典型，早期肺部体征不明显，常见肺内并发症有脓胸、胸腔积液、肺脓肿，严重者出现脓毒症甚至感染性休克。但SP肺炎与其他病原体如肺炎克雷白杆菌、肺炎杆菌肺炎、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、支原体肺炎等引起的肺炎的临床表现无明显特异性，需要病原学明确诊断［6］。

3.2 小儿SP 肺炎的病原学检测 （1）涂片染色：SP 革兰氏染色呈阳性球菌，菌体呈矛头状，成双或短链状排列，可快速获得病原学依据。（2）病原体培养、分离：是呼吸道病原学检测最常用的“金标准”，不仅可鉴定是否为致病菌，还可行药物敏感试验，指导抗菌素的准确使用。但耗时长，检出阳性率较低，不能作为早期诊断方法。（3）血清学检测：包括免疫层析试验快速检测SP 细胞壁上的多糖抗原和蛋白、酶联免疫吸附测定SP 抗原和抗体，对SP 感染具有肯定的诊断价值［7］。（4）分子生物学：①聚合酶链式反应（PCR），具有快速、特异性和灵敏度高、抗菌药物影响少的优势，可用于早期诊断，SP 表面抗原A（psaA）是SP 的最佳识别指标，实时荧光定量PCR 检测SP 的LytA、psaA、ply 基因特定序列区，可提高灵敏度［8］。②荚膜肿胀试验：是SP肺炎分型的“金标准”，但抗血清成本高，准确性可能受抗血清的批次影响。③多位点序列分型技术（MLST）：目前最常用的SP 分子分型方法之一，有利于发现基于荚膜多糖的传统血清学不能分型或新出现的变异。④高通量测序技术（mNGS）：对同一样本中的全部微生物DNA 先进行高通量测序，再与数据库进行比对，具有高效、敏感，在危重症、免疫缺陷、已用抗菌素及其他常规病原学检测（-）的SP 肺炎中具有优势，且可同时检测多种病原体。⑤全基因组测序（WGS）：可以鉴定细菌菌株是否为同一克隆，感染是否为暴发，可鉴定假定的疫苗靶标。但耗时长，费用贵，需特定的检测工具。生物学检测的最大缺点是不能明确检测到的序列是否有生命特性，如何解读检测到的（+）结果。本研究中A 组采用传统的培养法、B 组采用多重PCR 和Luminex 悬浮态芯片技术进行呼吸道病原体核酸检测，结果发现B 组不仅SP 的阳性率明显高于A 组，而且还发现了其他包括多种病毒、肺炎支原体、流感嗜血杆菌等的病原体，明显提高了儿童肺炎的病原体检出率。其原因可能是：SP 极易分泌多种自溶酶，若不及时送检可影响检验结果；采集痰标本为侵入性操作，小儿依从性差，加大了病原菌检测难度，不利于对呼吸道感染病原菌的精准诊断。另外，A 组检验结果的时间也明显长于B 组，提示B 组检测SP 的效率显著高于A 组。

3.3 小儿SP 肺炎的治疗 正确应用抗菌素治疗小儿SP肺炎至关重要。但临床上目前无快捷SP 肺炎的病原学检测方法，常在缺乏病原学前先采用经验性治疗，再根据临床疗效、肝肾心等器官功能、血象、病原学及药敏等调整抗菌策略，以达到精准治疗目的。治疗小儿SP 感染引起的肺炎首选青霉素类抗菌药物，并根据疾病的严重程度和是否有并发症确定给药途径和剂量。当病情可能迅速恶化时，医生还将使用耐药性较低的其他抗菌素，以便在没有细菌培养结果且没有药敏试验的情况下尽快控制病情［9］。综上所述，与常规SP 痰培养相比较，对小儿SP 肺炎患儿使用多重PCR 和Luminex 悬浮态芯片技术进行呼吸道病原体核酸检测，不仅可为临床医生提供更多病原学依据，而且高效、快速，便于在经验治疗的基础上加快调整至目标正确治疗，提高抗生素的合理使用率和治疗有效率，改善预后，但检测费用稍贵，建议临床推广应用。