糯玉米耐贮藏相关性状的主效QTL定位

蒋 锋 刘伟杰 陈青春 张姿丽 孙 伟 刘鹏飞*

(1.仲恺农业工程学院 农业与生物学院，广州 510225;2.广州市花都区狮岭镇农业农村办公室，广州 510326)

种子是农业生产中最基本的生产资料，也是植物生命周期的基本组成部分，储存着下一代所需的全部遗传信息[1]。种子质量的高低直接影响着良种特性的发挥，关系到农业生产的丰歉[2]。种子贮藏就是使用一定的贮藏设备和贮藏技术，有效地保持种子质量，从而保证种子的种用价值。提升种子的耐贮藏性对保持种子质量、保存和利用种质资源、延长种子的使用周期具有重要意义[3]。

种子耐贮藏性除受贮藏环境条件的制约外，同时还受其生理指标和遗传特性的影响[4-6]。调节种子贮藏环境如低温贮藏、超低温贮藏、超干贮藏、真空贮藏，可有效地延长种子寿命，延缓种子老化进程，增强种子耐贮藏性[3]。生理指标研究表明，种子内脂肪氧化酶活性、抗氧化酶活性和非酶类抗氧化物质含量等与种子耐贮藏性显著相关[7-15]。脂肪氧化酶可以与磷脂中的不饱和脂肪酸反应，降低细胞膜的流动性、完整性和透性，导致细胞液渗漏，最终引起种子活力逐步丧失[7-10]。已有研究表明过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽还原酶(GSHPX)等抗氧化酶可以清除种子在贮藏过程中产生的活性氧和自由基，增强种子的耐贮藏性[11-13]。此外，维生素C和E等非酶类抗氧化物质可防止脂质过氧化、清除活性氧，从而增强种子的耐贮藏性[14-15]。从遗传特性方面说，种子耐贮藏性是一个受多种因素影响的综合性的数量性状，对其进行遗传分析比较困难。然而，随着基因组作图技术的迅速发展，数量性状基因座(QTL)分析技术为研究种子耐贮藏性遗传提供了有力的工具[16]。已有研究通过自然老化和人工老化试验，对水稻[17]、小麦[18]、玉米[1,19-20]、大麦[21]、油菜[22]、拟南芥[23]和大豆[24]种子耐贮藏相关性状进行了QTL定位分析。

人工老化是采用高温、高湿处理种子，加速种子活力的丧失；自然老化是指种子在自然储藏的环境条件下逐渐丧失活力。人工老化可缩短老化时间，克服了自然老化所需时间较长的限制；自然老化试验周期长，但因符合种子贮藏的自然特性，更能反映种子贮藏实际[2]。人工老化和自然老化属于不同的基因调控系统[16]。因此,只有通过自然老化的方法,分析与挖掘耐储藏相关基因,才能更准确地了解其遗传机制，最终实现科研成果的实际应用。现有对玉米耐贮藏性QTL定位的研究多基于人工老化试验[1,19-20]。通过自然老化试验对玉米耐贮藏相关基因挖掘定位的研究尚未见报道。因此，本研究拟以2个耐贮藏性差异显著的糯玉米自交系N7和N32为研究对象，应用BSA群体分离分析法(Bulked segregant analysis)，以杂交组合N7×N32的216个F2单株为作图群体，构建遗传连锁图谱，并以各单株果穗种子储藏2年后的单位质量电导率和发芽率作为耐储藏性状指标数据，用复合区间作图法检测耐贮藏相关QTL，以期为耐贮藏相关QTL精细定位、图位克隆和标记辅助选择耐贮藏新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 亲本材料

试验亲本材料N7(母本)和N32(父本)是广东省鲜食玉米遗传育种工程技术研究中心选育而成的鲜食型糯玉米自交系。经多年试验鉴定，两亲本自交授粉后45 d收获的种子活力和发芽率均无显著差异，室温储藏1年以上，N32的种子活力与发芽率均显著高于N7。

1.2 田间试验设计

2016年春季，种植亲本自交系N7(不耐储藏)和N32(耐储藏)。配制杂交组合N7×N32，同时两亲本自交，收获两亲本及F1种子。

2016年12月底，在海南九所新村种植杂交组合N7×N32 的F1，自交获得F2种子。

2017年春季，同时种植两亲本、F1和F2。提取两亲本、F1和F2各单株叶片基因组DNA；各世代单株套袋自交授粉，于授粉后45 d收获果穗，风干脱粒，每单株果穗种子随机数取100粒装袋封口储藏，记录种子袋编号。

2017年8月—2019年8月，216个F2单株果穗种子室温储藏2年。

1.3 耐贮藏相关性状的数据获取

2019年8月，从封口袋中取出种子，将F2每一果穗上的100粒种子用去离子水清洗后分成2份，每份50粒分别称重，分别放入装有250 mL去离子水的杯子中，盖上杯盖浸泡24小时后，用电导率仪测得电导率，得出2个重复的电导率均值。

由于电导率与种子活力成负相关，将216个F2电导率数据进行线性转化。转化方法是：用216个电导率的最大值减去各F2单株的电导率，然后再归一化到0～100。经转化后的数值作为第一个耐贮藏性状值。

测得种子电导率后将同一果穗上的100粒种子，置于发芽盒，沙床28 ℃发芽，7 d后数出正常幼苗数，算出发芽率作为第二个耐贮藏性状值。

1.4 极端DNA池的组成

从216个F2果穗种子中挑选出单位质量电导率最小的20个，记录编号；同时挑出发芽率最高的20个，记录编号；将编号相同的种子对应的16个DNA混合组成极端耐储藏DNA池。挑出单位种子质量电导率最大的20个，同时挑出发芽率最低的20个，混合编号相同的种子对应的16个DNA组成极端不耐储藏DNA池。

1.5 DNA分子标记分析

采用CTAB法[25]提取DNA。据赵茂俊等[26]、Wang等[27]、于永涛等[28]、刘宗华等[29]和李永祥等[30]已发表过的玉米连锁遗传图谱合成引物，结合玉米遗传和基因组数据库(www.maizegdb.org)，选择分布于玉米10 对染色体上的 600 对 SSR引物对2个极端DNA池进行多态性标记筛选。针对多态性引物所在的染色体，增加引物，以F2为作图群体构建分子标记连锁图谱，结合F2果穗种子的2个贮藏性状值扫描耐贮藏相关QTL。

SSR 引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。参照张军等[31]的PCR 反应体系、聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色方法进行。

1.6 连锁群构建及QTL定位

采用JoinMap 3.0软件对216个F2单株的多态标记基因型进行连锁关系分析，构建分子标记连锁图谱[32]。采用WinQTLCart2.5软件，复合区间作图法扫描耐贮藏相关QTL。LOD(Likelihood of Odd)阈值为3.0。

按照“q+性状+染色体号+数字”命名QTL。性状以英文缩写表示，如电导率QTL以CE(Converted electroconductibility)表示，发芽率QTL以GP(Germination percentage)表示。同一条染色体上的各QTL以数字表示。

2 结果与分析

2.1 亲本及F2耐贮藏相关性状的参数统计

贮藏2年后，N7和N32果穗种子的单位质量电导率(CE)分别为(7.64±4.1)μS/(cm·g)和(93.4±3.3)μS/(cm·g)，两亲本差异极显著；N7的发芽率(GP)平均值为(70.0±0.8)%，N32的发芽率平均值为(86.9±1.0)%，两亲本差异极显著。

216个F2果穗种子的CE(图1(a))和GP(图1(b))分布见图1。由两亲本和F2的CE和GP值算得CE的遗传方差为538.9 (μS/(cm·g))2，环境方差为13.9 (μS/(cm·g))2；GP的遗传方差为23.1(%)2，环境方差为0.8(%)2，2个耐贮藏指标的遗传方差均>环境方差，适合作QTL定位分析。

图1 216个F2单株种子贮藏2年后单位质量电导率及发芽率分布Fig.1 Distribution of converted electroconductibility (a)and germination percentage (b)after 2 years storage in 216 F2 individuals

2.2 DNA混池间多态性标记筛选

用600对玉米SSR引物在耐储藏DNA池和不耐贮藏DNA池之间进行多态性引物筛选，发现位于第4号染色体上的引物umc1284和位于第6号染色体上的bnlg2097在混合DNA池间存在差异。

2.3 遗传连锁图谱的构建

在第4和6染色体上分别设计100对SSR引物，并在亲本间筛选其中的多态性标记。以杂交组合N7×N32的F2为作图群体，利用Joinmap3.0软件构建玉米第4和第6染色体的分子标记连锁图，结果见图2。可知：在第4染色体的连锁图的长度为113.68 cM，含有18个SSR分子标记；在第6染色体的连锁图的长度为121.24 cM，包含21个SSR分子标记。

黑色矩形区域和须状线区域分别代表1-LOD置信区间和2-LOD置信区间。Bars and whiskers indicate 1-LOD and 2-LOD QTL likelihood intervals,respectively.图2 遗传连锁图谱及耐贮藏相关QTL分布Fig.2 Genetic linkage map and storability related QTL distribution

2.4 耐贮藏相关QTL定位分析

2.4.1电导率的QTL定位

结合216 个F2果穗种子的CE和分子标记数据，用WinQTLCart 2.5软件，采用复合区间作图法在第4和6染色体上扫描QTL，结果见图2。在第4染色体上定位到1个QTL(qCE-4-1)，位于分子标记bnlg1265～bnlg1755，加性效应为-18.96，显性效应为3.58，贡献率是30.5%(表1)，LOD值为19.3(图3)；第6染色体上定位到2个电导率QTL(qCE-6-1、qCE-6-2)，分别位于umc1014～bnlg1154和phi077～bnlg2097，加性效应分别为-10.41和12.10，显性效应分别为11.35和20.85，可分别解释15.0%和5.4%的表型变异(表1)，LOD值分别为11.2和4.7(图3)。

2.4.2发芽率的QTL定位

分子标记数据结合F2果穗种子的发芽率，采用复合区间作图法在第4和6染色体上检索QTL。结果显示，在第4染色体上定位到1个QTL(qGP-4-1)，位于标记区间bnlg1265～bnlg1755上，加性效应为-3.63，显性效应为0.73，贡献率是25.9%(表1)，LOD值为18.1(图3)。第6染色体上定位到3个QTL(qGP-6-1、qGP-6-2、qGP-6-3)分别定位于umc1014～bnlg1154、bnlg1154～umc1614和umc1127～umc1248上，加性效应分别为-2.41、-2.73和-1.31，显性效应分别为0.40、1.91和1.46，可分别解释10.3%、8.2%和4.6%的表型变异(表1)，LOD值分别为8.2、5.6和3.4(图3)。

图3 耐贮藏相关性状LOD值在连锁群上的分布Fig.3 LOD distribution of storability related traits in linkage

表1 复合区间作图检测到的耐贮藏相关QTLTable 1 Storability related QTL with the method of CIM

3 讨 论

作物种子耐贮藏相关QTL定位研究主要集中在水稻、小麦、拟南芥上，对玉米种子的耐贮藏性相关QTL的研究报道不多。Wu等[19]对148个甜玉米BC4F3单株进行简化基因组测序，结合人工老化后测得的4个发芽性状指标，定位到18个耐贮藏相关QTL。其中qGR10在第10染色体上，在2季实验中均被检测到。Han等[20]用8个人工老化处理，在2个有共同父本的重组自交系群体里检测到4个稳定的主效耐贮藏QTL，分别位于第2、3和5染色体上。Wang等[1]用多种人工老化处理，在重组自交系群体和永久F2群体中同时定位到一个稳定的主效耐贮藏QTL(qGP5)，位于第5染色体bin5.01上。本研究，通过测定自然老化的糯玉米种子的2个耐贮藏指标，应用连锁分析的方法在F2群体中检索到7个耐贮藏相关QTL，分别位于第4和6染色体上。

Tanksley[33]指出，贡献率>10%的QTL可视为主效QTL。本研究在第4染色体标记区间bnlg1265～bnlg1755内同时定位到电导率和发芽率2个指标的QTL(qCE-4-1和qGP-4-1)，LOD值分别为19.3和18.1，贡献率分别为30.5%和25.9%，表明在bnlg1265～bnlg1755标记区间内可能存在1个稳定的主效耐贮藏QTL。同时，在第6染色体umc1014～bnlg1154内同时定位到电导率和发芽率2个指标的QTL(qCE-6-1和qGP-6-1)，LOD值分别为11.2和8.2，贡献率分别为15.0%和10.3%，表明在第6染色体umc1014～bnlg1154区间内可能也存在1个稳定的主效耐贮藏QTL。后期将通过扩大群体、加大标记密度对主效耐贮藏QTL进行精细定位，找到可用于辅助选择的分子标记，以期应用于育种实践。

4 结 论

本研究以糯玉米组合N7×N32的F2为作图群体，应用BSA方法，以自然老化后种子电导率和发芽率为耐贮藏指标，在第4和6染色体上定位到7个耐贮藏相关QTL。其中，在第4染色体bnlg1265～bnlg1755和第6染色体umc1014～bnlg1154内分别定位到2个稳定的耐贮藏指标主效QTL。