抑制长非编码RNA 配对盒8 反义RNA 1 对心肌缺血再灌注细胞氧化应激和细胞凋亡水平的影响

朱新华，侯静雯，刘蓓蓓，许慧娟，李秋影，张晓阳

（新疆医科大学第五附属医院老年病科，乌鲁木齐 830000）

心肌缺血再灌注（myocardial ischemia-reperfu⁃sion，MI/R）损伤是由于心肌长时间缺血，当恢复供血后造成冠状动脉血流量下降，心脏收缩功能降低，血管反应性改变，进而造成严重的再灌注损伤和心肌功能障碍［1］。长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种内源性的细胞RNA，其长度在200 nt 到100 kb 之间，已有研究发现lncRNAs 在许多心血管疾病中发挥重要作用［2-3］。配对盒8（PAX8）是一种编码胚胎发育过程中细胞生长和分化所需的转录因子，其异常表达已在多种类型的肿瘤中检测到。PAX8 反义RNA 1（PAX8-AS1）是PAX8 的一个潜在调节因子，有研究发现PAX8-AS1 可能是宫颈癌的新型易感标记［4］。然而，目前关于PAX8-AS1表达对MI/R损伤的影响研究较少，因此，本研究探讨抑制lncRNA PAX8-AS1 对MI/R损伤的保护作用，为临床治疗MI/R 提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料及主要试剂

H9c2 心肌细胞、叔丁基过氧化氢（tert-Butyl hydroperoxide，TBHP）购自美国Sigma 公司；Trizol、Lipofectamin 2000 购自美国Invitrogen 公 司；si-PAX8-AS1 及对应siRNA 对照购自广州市锐博生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosor⁃bent assay，ELISA）试剂盒、超氧化物歧化酶（su⁃peroxide dismutase，SOD）ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（TBA 法）购自北京百奥莱博科技有限公司；B 细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）兔单克隆抗体、Bcl-2 相关X 蛋白质（Bcl-2 associated X protein，Bax）兔单克隆抗体、β 肌动蛋白（β-actin）兔单克隆抗体购自美国Abcam 公司；山羊抗兔二抗购自美国LI-COR 公司。

1.2 细胞模型建立及分组

以H9c2心肌细胞为研究对象，将细胞分为4组：空白对照组、MI/R 组、si-con 组、si-PAX8-AS1 组。采用TBHP 构建MI/R 损伤细胞模型［5］：将细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基中，置于37 ℃、5%二氧化碳的培养箱中培养。取对数生长期的细胞（1×105个/孔）接种至6 孔板中，加入500 μL TBHP（100 μmol/L），培养12 h，模拟缺氧环境；培养后用DMEM 高糖培养基继续培养，进行再灌注。si-con 组：在MI/R 模型建立后培养24 h，采用转染试剂脂质体Lipofectamin 2000 转染si-con（5 nmol/L）；si-PAX8-AS1 组：在MI/R 模型建立后培养24 h，采用转染试剂脂质体Lipofectamin 2000转染si-PAX8-AS1（5 nmol/L）；转染后5 h 更换新的DMEM 高糖培养基，37℃、5%二氧化碳条件下继续培养48 h 后进行后续实验。空白对照组：细胞不做处理。

1.3 qRT-PCR 检测各组心肌细胞PAX8-AS1 的表达水平

取各组细胞分别加入1 mL Trizol，冰上静置5 min，加入200 μL 氯仿上下混匀冰上静置15 min，4 ℃条件下12 000 rpm 离心15 min。吸取上层清液至新的离心管中加入500 μL 异丙醇，混匀后冰上静置20 min，4℃条件下12 000 rpm 离心10 min，弃去上清液加入1 mL 75%无水乙醇，4℃条件下12 000 rpm 离心5 min，弃去上清液，室温静置5 min至离心管干燥，加入DEPC 水溶解沉淀后检测RNA的浓度和纯度，并按照反转录试剂盒说明书操作将总RNA 反转成cDNA，取1 μL cDNA 作为模板进行实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）扩增。反应条件：预变性95℃5 min，95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，40 个循环后72℃延伸10 min。每个样本重复检测3 次。以GAPDH 为内参，每组基因的相对表达量按公式（2-△△Ct法）计算。引物设计见表1。

表1 qRT-PCR 检测基因引物序列

1.4 检测各组细胞MDA、SOD 和GSH-PX 浓度

收集各组对数生长期心肌细胞H9c2，加磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，进行超声破碎。1 500 rpm 离心10 min，取上清液。按照试剂盒说明书操作步骤检测各组细胞MDA、SOD 和GSH-PX 浓度。

1.5 流式细胞术检测心肌细胞凋亡率

各组细胞按1×105个/孔接种于6 孔板，加磷酸盐缓冲液洗涤细胞2 次，加入0.25%胰蛋白酶进行消化，加入500 μL 心肌细胞培养液，1 000 rpm 离心5 min，弃上清液。加入300 μL Binding Buffer 重悬细胞，再加入5 μL Annexin V 和PI，轻轻混匀，室温避光反应10 min，流式细胞仪检测细胞荧光强度。

1.6 Western blot检测各组细胞Bax、Bcl-2蛋白表达

收集各组对数生长期细胞弃培养基，用冰磷酸盐缓冲液洗涤细胞3 次，加入RIPA 裂解液，充分裂解后12 000 rpm 离心30 min，取上清并对蛋白进行定量。取40 μg蛋白与上样缓冲液混合，100℃加热5 min 后通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，90 V 电压转膜至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜后加入Bax、Bcl-2 一抗4℃过夜，加入二抗孵育2 h，用化学发光法显色，凝胶成像系统拍照。以β-actin 为内参，每组实验重复3 次。

1.7 统计学分析

采用SPSS 24.0 统计软件进行数据分析，PAX8-AS1 mRNA 表达水平、MDA、SOD 和GSH-Px浓度和Bax、Bcl-2 蛋白表达结果用（）表示，采用单因素方差分析比较多组间差异，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。细胞凋亡率用［n（%）］表示，采用卡方（χ2）检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组H9c2 细胞PAX8-AS1 mRNA 表达水平比较

空白对照组、MI/R 组、si-con 组、si-PAX8-AS1组H9c2 细胞PAX8-AS1 mRNA 表达水平分别为1.00±0.06、2.59±0.04、2.63±0.08、1.41±0.03。单因素方差分析结果显示，与空白对照组相比，MI/R 组、si-con 组、si-PAX8-AS1 组PAX8-AS1 mRNA 表达水平均显著升高，差异具有统计学意义（F=687.811，P＜0.05）；进一步组间两两比较结果显示，与si-con组相比，si-PAX8-AS1 组H9c2 细胞PAX8-AS1 mRNA 表达水平显著降低，差异有统计学意义（LSD-t=27.281，P＜0.05），见图1。

图1 各组细胞PAX8-AS1 mRNA 表达水平比较（n=3）

2.2 各组H9c2细胞MDA，SOD和GSH-PX浓度比较

单因素方差分析结果显示，与空白对照组相比，MI/R 组、si-con 组、si-PAX8-AS1 组H9c2 细胞MDA 浓度显著升高，SOD 和GSH-Px 浓度均显著降低，差异有统计学意义（均P＜0.05）；进一步组间两两比较结果显示，与si-con 组比较，si-PAX8-AS1组H9c2 细胞MDA 浓度降低，SOD 和GSH-Px 浓度均升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 各组H9c2细胞MDA，SOD和GSH-PX的浓度比较［n=3，］

表1 各组H9c2细胞MDA，SOD和GSH-PX的浓度比较［n=3，］

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与si-con 组比较，1）*P＜0.05

2.3 各组H9c2 细胞凋亡率比较

单因素方差分析结果显示，与空白对照组（5.88%±0.88%）相比，MI/R 组、si-con 组、si-PAX8-AS1 组H9c2 细胞凋亡率（22.41%±1.11%、21.71%±1.12%、11.20%±1.60%）显著升高，差异有统计学意义（F=135.784，P＜0.05）；进一步组间两两比较结果显示，与si-con 组相比，抑制PAX8-AS1 表达后，H9c2 细胞凋亡率显著降低，差异有统计学意义（LSD-t=10.680，均P＜0.05），见图2。

图2 各组H9c2 细胞凋亡率流式细胞图比较（n=3）

2.4 各组H9c2 细胞Bax、Bcl-2 蛋白表达比较

单因素方差分析结果显示，与空白对照组（0.20±0.02、1.41±0.07）相比，MI/R 组、si-con 组、si-PAX8-AS1 组H9c2 细胞Bax 蛋白表达（1.21±0.06、1.19±0.06、0.90±0.06）显著升高，（F蛋白=281.403，P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表达（0.35±0.03、0.33±0.04、1.00±0.06）显著降低（F蛋白=325.397，P＜0.05），差异均有统计学意义；进一步组间两两比较结果显示，抑制PAX8-AS1 表达后H9c2 细胞Bax 蛋白表达降低（LSD-t蛋白=7.158，P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表达升高（LSD-t蛋白=16.223，P＜0.05），差异均有统计学意义，见图3。

图3 各组H9c2 细胞Bax、Bcl-2 蛋白表达比较（n=3）

3 讨论

细胞内氧化还原状态调节着细胞功能的各个方面，有研究发现，MI/R 损伤细胞模型中MDA 浓度升高，SOD、GSH-Px降低［6］。因此，减少氧化应激是改善心肌MI/R损伤的关键治疗策略。Zhang等［7］研究发现，厚朴酚减少了心肌的氧化损伤和细胞凋亡，从而改善了核因子E2 相关因子2 信号依赖途径中MI/R 损伤。Kosuru 等［8］研究发现，紫檀可通过激活糖尿病大鼠体内二磷酸腺苷（AMP）依赖的蛋白激酶信号通路抑制心脏氧化应激和细胞凋亡，减轻心肌MI/R 损伤。

近年来，越来越多的研究表明，氧化应激与lncRNA 具有紧密的联系，lncRNA 被认为是涉及氧化应激、炎症等过程的重要因子。PAX蛋白在胚胎发育过程中的器官发生中起着转录因子的作用，调节细胞增殖和自我更新，抵抗凋亡，调控胚胎前体细胞迁移以及特定分化程序［9-10］。本研究构建MI/R损伤细胞模型后转染si-PAX8-AS1构建PAX8-AS1表达抑制模型，结果发现与空白对照组相比，MI/R组、si-con 组、si-PAX8-AS1 组PAX8-AS1 mRNA 表达水平均显著升高；与si-con组相比，si-PAX8-AS1组PAX8-AS1 mRNA 表达水平显著降低，提示本研究成功转染si-PAX8-AS1。此外，MI/R 组MDA 浓度显著升高，SOD 和GSH-Px 浓度与空白对照组相比降低；抑制PAX8-AS1表达后细胞中MDA浓度降低，SOD 和GSH-Px 浓度均升高，提示降低PAX8-AS1 表达可抑制MI/R 损伤细胞氧化应激水平。

细胞凋亡是缺血性心肌细胞损伤的重要指标，可反映心肌组织的情况，在心血管疾病中发挥重要作用。有研究表明，氧化应激和MI/R 损伤不仅导致心肌坏死，而且诱导心肌细胞凋亡［11］。本研究采用流式细胞术检测各组细胞凋亡水平，与空白对照组相比，MI/R 组、si-con 组心肌细胞凋亡率显著升高；与si-con 组相比，抑制PAX8-AS1 表达后，心肌细胞凋亡率显著降低；此外，MI/R 组、si-con 组、si-PAX8-AS1 组Bax 蛋白表达均显著高于空白对照组，而Bcl-2 蛋白表达均显著降低；抑制PAX8-AS1 表达后，Bax 蛋白表达均降低，而Bcl-2 蛋白表达均升高，提示抑制PAX8-AS1 表达后可降低MI/R 损伤细胞凋亡率。

综上所述，抑制PAX8-AS1 表达后可抑制MI/R 损伤细胞氧化应激水平并降低细胞凋亡率，为临床治疗MI/R 提供新思路。