老年重症肌无力患者浆细胞样树突细胞与调节性T细胞的变化与临床意义

王思微 牛韵婷 张婷婷

(1辽宁中医药大学附属医院临床检验中心，辽宁 沈阳 110032；2沈阳医学院)

重症肌无力(MG)是一种机体产生抗神经肌肉接头乙酰胆碱受体(AChR)抗体等自身抗体的自身免疫性疾病，导致神经递质在突触后膜传递障碍，出现骨骼肌疲劳的临床表现，具有组织器官特异性〔1〕。其发病机制往往与机体的免疫功能失衡相关。调节性T细胞(Treg)是一种介导免疫耐受的CD4+细胞，其主要功能是通过控制T细胞的活化与增殖来抑制体内的免疫反应，使重症肌无力的炎症反应趋于慢性〔2〕。树突细胞(DC)是一种专职抗原提呈细胞，在T细胞介导的免疫反应与免疫耐受环节有重要作用，根据不同来源与功能可分为髓样DC(mDC)与浆细胞样DC(pDC)，pDC可以诱导自然调节性T细胞(nTreg)的分化维持机体的自身免疫耐受，并诱导B细胞分化为浆细胞，与MG等自身免疫性疾病发生与发展有关，但研究甚少。本研究旨在分析MG患者外周血中pDC与Treg细胞的含量，探讨其介导的免疫反应异常在MG患者中的表现。

1 资料与方法

1.1研究对象 2018年7月至2020年6月就诊于辽宁中医药大学附属医院神经内科的老年初诊并未接受治疗的MG患者112例，其中男58例，女54例，年龄60～83岁，平均(72.85±8.13)岁。纳入标准：患者均按照MG治疗和诊断中国专家共识〔3〕明确诊断为MG；不合并其他自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等)；不合并肿瘤、感染等疾病；无严重的心脑血管疾病；无精神类疾病能配合研究。将MG组分为无胸腺受累组60例与胸腺受累组52例(按照影像学与病理学诊断划分)。按照MG定量评分(QMG)标准对患者进行评分。另外选取同期健康体检人员68例为对照组，年龄61～78岁，男35例，女33例。3组性别、年龄无统计学差异，均知情同意，研究通过辽宁中医药大学附属医院伦理委员会批准。

1.2主要仪器与试剂 试剂：人外周血单个核细胞分离液，购自挪威Axis-Shield公司；人Treg试剂盒，荧光标记为Foxp3(PCH101)-APC，CD4-FITC，CD25-PE，购自eBioscience公司；荧光标记为Lin-1-FITC，CD123-PE，anti-HLA-DR-PerCP，CD11c-APC的单克隆抗体均购自美国BD公司；人乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、人白细胞介素(IL)-4 ELISA试剂盒、人γ干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒，均购自南京森贝咖公司。设备：FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)，美国SpectraMax iD3多功能酶标仪。

1.3标本采集与处理 研究对象清晨空腹采集静脉全血5 ml至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，用3 ml生理盐水稀释3 ml全血，室温下在3 000 r/min离心力低速离心机中离心20 min，用洁净吸管吸取中间层的淋巴细胞层，移至另一离心管中，用2倍体积的生理盐水稀释收集到的淋巴细胞，在1 500 r/min的离心力下，离心10 min，弃去上清，取沉淀，即为淋巴细胞，用于pDC与Treg细胞的检测。另按上述条件采集5 ml全血，室温13 000 r/min离心10 min，收集血清用于IL-4与IFN-γ的检测。

1.4流式细胞术检测pDC与Treg 将分离后的淋巴细胞悬液用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释浓度至1×106个ml。pDC的流式检测：取流式专用洁净试管加入稀释好的淋巴细胞100 μl，加入Lin-1-FITC抗体20 μl，CD123-PE抗体10 μl，anti-HLA-DR-PerCP抗体10 μl，CD11c-APC抗体5 μl，涡旋震荡混匀，室温避光反应15 min，1 500 r/min离心5 min，弃去上清，加入1 ml PBS洗涤细胞，1 500 r/min离心5 min，弃去上清，加入300 μl PBS缓冲液混匀，准备上机操作。其中Lin-1-anti-HLA-DR+CD123+CD11c-的细胞群为pDC。Treg细胞的流式检测：将100 μl稀释好的悬液加入另一试管中，加入CD4-FITC、CD25-PE单克隆抗体各10 μl，涡旋震荡混匀，室温避光反应30 min，加入PBS 1 ml洗涤细胞，加入破膜剂250 μl，1 200 r/min离心5 min弃上清，加入Foxp3-APC抗体10 μl，加PBS 300 μl准备上机操作。应用四色流式细胞仪上机操作，应用BD CellQuest Pro分析软件进行结果分析。

1.5ELISA检测血清IL-4与IFN-γ 将收集好的血清用ELISA检测IL-4与IFN-γ，操作均严格按照说明书进行，ELISA试剂盒采用五点定标，两个浓度的质控品均在控，且具备符合检测要求的线性条件及其他性能要求。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、方差分析、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1各临床资料比较 胸腺受累组及无胸腺受累组与对照组比较AChR-Ab含量较高，差异有统计学意义(P<0.05)；胸腺受累组较无胸腺受累组病程较长、QMG评分较高、AChR-Ab含量较高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2不同组别pDC、Treg、IL-4、IFN-γ的含量 胸腺受累组与对照组相比，pDC、Treg、IL-4含量明显减低，IFN-γ含量明显升高(P<0.05)；无胸腺受累组与对照组相比，pDC、Treg细胞含量明显减低，IFN-γ含量明显升高(P<0.05)；胸腺受累组与无胸腺受累组相比，pDC明显减低，IFN-γ明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3组临床资料及pDC、Treg细胞，IL-4、IFN-γ含量比较

2.3各指标之间的相关性 Treg、IL-4与pDC呈正相关(r=0.840、0.780，P<0.05)，IFN-γ、QMG评分、AChR-Ab与pDC呈负相关(r=-0.773、-0.760、-0.816，P<0.05)；IFN-γ、QMG评分、AChR-Ab与Treg呈负相关(r=-0.792、-0.734、-0.816，P<0.05)，IL-4与Treg无显著相关性(r=0.356，P>0.05)。

3 讨 论

老年MG因其自身运动神经系统功能衰退或合并其他心脑血管或自身免疫性疾病而常导致MG的临床症状不明显而误诊或漏诊，发病早期不易被发现〔4〕。老年MG患者90%可检测到AChR抗体，高于其他年龄组〔5〕，并存在更高合并胸腺病变的可能性，我国学者研究发现老年MG有26.5%合并胸腺瘤〔6〕。MG是一种自身免疫性疾病，是由T细胞介导，补体参与的产生特异性AChR抗体的免疫失衡状态下的多系统受累的疾病。其免疫系统状态的研究是探索疾病形成与发展的重要切入点。DC的功能强大，一方面具有专职抗原呈递的功能；另一方面诱导初始T细胞成为CD4+T细胞进行重要的特异性免疫功能，与此同时其在免疫耐受与免疫稳态中也发挥重要作用。根据DC的分化成熟程度，成熟DC发挥抗原呈递功能，其表面高表达主要组织相容性复合体(MHC)分子在内的多种分子可诱导T细胞的活化，发挥特异性免疫效能；而未成熟DC能识别、处理抗原信息，但缺乏共刺激分子不能使之与T细胞表面受体结合，使T细胞趋于免疫耐受状态〔7〕。

DC在自身免疫性疾病的研究中也逐渐被重视，异常的免疫激活是自身免疫疾病发病的重要环节。系统性红斑狼疮(SLE)患者表现出更高比例的活化mDCs，SLE患者的mDC和pDC均表现为与其成熟、功能和信号传导相关的基因表达的改变，并与血清抗双链DNA(dsDNA)抗体显著相关〔8〕。根据DC来源不同，将其区分为mDC与pDC，mDC诱导中间阶段辅助性T淋巴细胞(Th0细胞)向Th1细胞方向分化，参与特异性免疫应答；而pDC诱导Th0细胞向Th2细胞方向分化，参与免疫耐受。DC与MG的关系的研究中发现，在MG患者的胸腺组织中发现经典DC(cDC)密度明显增高，尤其集中于异位生发中心及其周围，证明MG患者胸腺组织不同部位与不同DC种类含量有差异,在组织及外泌体中均有此发现〔9,10〕。Pei等〔11〕对MG患者外周血DCs进行了定量分析发现DC绝对数量减少，mDC/pDC减低，证明外周血两种DC组分失衡，机体处于自身免疫反应与免疫耐受之间的失衡状态。

本研究提示在外周的抗原性刺激发生后，pDC含量的下降导致机体免疫耐受程度降低，机体诱发强有力的免疫应答，AChR抗体含量增加，加速自身免疫疾病的发展。胸腺具有大量免疫细胞和免疫分子，是T淋巴细胞与B淋巴细胞天然发育的重要场所，是人类重要的中枢免疫器官，胸腺与MG关系密切〔12〕，MG患者约有80%合并胸腺异常，其中包括胸腺瘤或胸腺增生等〔13〕。DC是一种胸腺基质细胞，其参与T细胞在胸腺内的分化与选择。一些研究中发现，pDC会从外周血转移至其他组织器官中，参与自身免疫病的形成或组织的破坏〔14〕。本研究显示，在外周血淋巴细胞中的pDC减少，证明胸腺受累后外周组织的免疫平衡遭到破坏，但是胸腺受累的MG患者下降更低的情况可能与机体接受免疫刺激之后，大量pDC从外周血转移至胸腺组织中，结合其在自分泌大量趋化因子的迁移特性，逐渐成熟过程中参与特异性免疫的应答，并促使MG在胸腺中的破坏，此结果印证了MG患者胸腺中DC含量升高〔9〕与本研究外周血含量下降的特征。

如上述DC诱导强有力的免疫应答的同时，仍发挥诱导免疫耐受的作用。其中pDC可能通过两种方式参与免疫耐受的形成，一方面通过抑制T细胞的免疫应答减弱过强的免疫反应；另一方面通过诱导Treg生成，发挥其在外周的免疫耐受功能。Treg是CD4+T细胞的一种亚型，其整体的作用是使免疫反应得到抑制与耐受，与慢性感染或肿瘤的形成关系密切〔15〕。本研究所探讨的是免疫表型为CD4+CD25+FoxP3+的自然Treg，其特定的表达转录因子Foxp3，可以分化为其他类型的Treg。Treg数量及功能上的失调导致T细胞被异常激活而形成的自身免疫性损伤也是许多自身免疫性疾病的重要原因。一些研究表明在MG患者中Treg含量减低，所致进一步的病理损伤〔16〕，本研究也验证这一观点。同时，本研究又发现，pDC与Treg在维持MG患者的免疫耐受过程中可能发挥一致性的作用，两者下降程度呈正相关。正如其他研究发现，DC缺乏小鼠会引起自身免疫的发生，并且DC的减少可以改变外周Treg基因表达谱的改变，DC通过调节Treg功能而保持免疫平衡〔17〕。两者也被认为与肿瘤免疫逃逸的免疫耐受失衡相关，Hang等〔18〕研究发现在甲状腺癌患者中Foxp3+Treg数量明显减低，提示pDCs可诱导初始CD4+T细胞向Foxp3+Treg分化，两者共同促使肿瘤的免疫逃逸。本研究也发现pDCs与Treg在外周血中同时减低，且具有相关性，可能提示MG患者DC诱导Treg功能减弱，抑制过强的T细胞反应能力减弱，诱发免疫失衡，进一步加重自身免疫抗体对自身的攻击。

DC细胞在诱导Th细胞向Th1或Th2方向发展时，常分泌相应的细胞因子，IL-12可使Th0细胞向Th1方向发展，并分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子；而IL-4可使Th0细胞向Th2方向发展，并分泌IL-4、IL-6、IL-10等细胞因子。本研究提示T细胞可能正处于向Th1方向发展的趋势，存在较强的免疫反应。综上所述，老年MG患者外周血pDC、Treg减低，可能诱导免疫耐受功能下降，机体处于一个较强的免疫应答状态，影响疾病的发生和发展。