丹皮酚对高糖诱导心肌细胞PI3K-Akt信号通路的影响

武单单， 周晓慧

(承德医学院，河北 承德 067000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy)是指糖尿病患者排除高血压和冠心病，单纯由高血糖引起的心肌疾病。其病理特征主要表现为左心室的肥大和早期舒张功能的损害，伴随心肌炎症、心肌纤维化、心肌细胞凋亡，晚期可能伴有收缩功能障碍[1-2]。其心脏结构和功能的改变是糖尿病心肌病引起心力衰竭，发生死亡的主要因素之一[3]。在引起糖尿病心肌病的因素中，心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病的重要发病环节。因此抑制心肌细胞凋亡可缓解糖尿病心肌病发生发展。丹皮酚又称牡丹酚，是中药牡丹皮(毛莨科植物牡丹的干燥根皮)和徐长卿(萝藦科植物徐长卿的干燥根及根茎)的主要成分，丹皮酚是一种小分子酚类化合物，是一类天然活性物质，毒性极低。现代药理学研究表明丹皮酚具有广泛的药理作用，如抗氧化[4]、抗炎[5]、降血脂、降血糖[6]等，本课题组前期通过体内实验已证实，丹皮酚对大鼠糖尿病心肌病起保护作用[7]。本实验通过心肌细胞的原代培养，高糖刺激模拟临床糖尿病患者体内高血糖的内环境，在细胞水平上探讨丹皮酚防治糖尿病心肌病发挥作用的确切分子机制，为研发早期抑制糖尿病心肌病发生发展的新药提供有价值的理论和实验依据。

1 材料

1.1 动物 1～3 d新生SD乳鼠10～16只，雌雄不限，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(京)2016-0006，本研究获得承德医学院动物伦理委员会批准(编号20190101)。

1.2 试剂与药物 丹皮酚磺酸钠注射液(金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂，主要成分为丹皮酚磺酸钠，辅料为依地酸二钠、亚硫酸氢钠、甘油，规格2 mL:0.1 g，批号180202)。胰酶、细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、台盼蓝染色液(北京索莱宝科技有限公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Excell Bio公司，批号11I059)；5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxy uridine，BrdU)、噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tet-razolium bromide，MTT)(美国Sigma公司)；AnncxinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(美国BD公司， 批号 556547)；细胞计数板(美国Thermo公司)；兔抗Akt(武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号3515345201)；兔抗Bcl-2(美国Santa Cruze公司，批号k1918)；兔抗Bcl-xL、Bax、caspase3、cleaved-caspase3、CytC(美国CST公司，批号2764、2772、9662、9661、11940)；兔抗 β-actin(北京博奥森生物技术有限公司)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京义翘神州科技股份有限公司)。

1.3 仪器 超净工作台(上海博讯实业有限公司)；细胞培养箱(美国Thermo公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪[碧迪医疗器械(上海)有限公司]；200目细胞滤网(北京索莱宝科技有限公司)；CountessⅡ自动细胞计数仪(美国Life公司)；立式蒸汽高压锅(日本Tomy公司)；低温高速离心机(澳大利亚Dynamica公司)；酶标仪(美国BioTek公司)；DYY-BC型电泳仪(北京市六一仪器厂)；全自动快速凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 新生乳鼠原代心肌细胞的制备 取新出生1～3 d新生SD乳鼠，不分雌雄，用75%乙醇消毒3次后，置于超净台上，取心尖部分前，将乳鼠胸骨部分用75%乙醇进行第4次消毒，在剑突上一肋剪开胸骨，挤出心脏，用灭菌的眼科弯剪，剪去心脏前1/3的心室部分，放入盛有4 ℃预冷PBS液的1号培养皿中，再次用灭菌好的眼科弯镊放入盛有4 ℃预冷PBS液的2号培养皿中，依次清洗，去掉血污。将清洗好的心肌组织用直剪和直镊剪成0.5～1 mm3体积的小组织块，用1号吸管将心肌组织吸入15 mL离心管中，用吸管将PBS吸出。用2号吸管吸取2 mL 0.25%胰蛋白酶清洗1 min，匀速摇晃离心管，将胰酶弃除。用2号吸管吸取2 mL 0.25%胰蛋白酶消化，匀速摇晃离心管，待观察到胰酶浑浊后，吸出单细胞悬液，放入提前装有30 mL 12%低糖DMEM培养基中终止消化。多次重复上一步，直至胰酶不再浑浊，且心肌组织由红色变成透明状的絮状物。将收集到的所有心肌细胞，经200目细胞网筛过滤。将滤完的心肌细胞离心，1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入新的培养基，吹打、混匀，接种于大皿中。将大皿放入5% CO2、37 ℃细胞培养箱中，用差速贴壁法培养细胞90 min。先贴壁的为成纤维细胞，未贴壁的心肌细胞悬液。按照心肌细胞悬液∶台盼蓝染液=9∶1的比例，将细胞密度调整为1×106/mL，并接种于6孔板中，并加入BrdU(0.1 mmol/L)以抑制成纤维细胞分裂增生。

2.2 MTT法筛选药物质量浓度 实验分为空白组(无细胞，只有培养液)、正常对照组(有细胞，葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)、丹皮酚给药组(25、30、35、40、45、50 μg/mL)，每组设置6个复孔，按照1×105/mL的密度接种在96孔板，每孔100 μL，放入5% CO2、37 ℃细胞培养箱中，加药培养48 h后，每孔加入10 μL质量浓度为5 mg/mL的MTT，在培养箱中孵育4 h。将上清吸除以后，每孔中加入二甲基亚砜溶液150 μL，避光，室温反应10 min。用酶标仪检测每孔490 nm的吸光度(A)值。实验重复3次，取均值。

2.3 高糖诱导心肌细胞损伤模型的制备 心肌细胞培养48 h后，用无FBS的高糖DMEM(35 mmol/L)培养基处理48 h。

2.4 实验分组及给药 将原代心肌细胞分离培养后的第3天，随机分为以下5组，正常对照组加入不含FBS的低糖DMEM培养基；高糖组加入不含FBS、葡萄糖终浓度为35 mmol/L的DMEM培养基；丹皮酚低剂量组加入不含FBS、葡萄糖终浓度为35 mmol/L的DMEM培养基、终质量浓度10 μg/mL的丹皮酚；丹皮酚中剂量组加入不含FBS、葡萄糖终浓度为35 mmol/L的DMEM培养基、终质量浓度20 μg/mL的丹皮酚；丹皮酚高剂量组加入不含FBS、葡萄糖终浓度为35 mmol/L的DMEM培养基、终质量浓度40 μg/mL的丹皮酚。

2.5 流式细胞术检测心肌细胞凋亡率 细胞凋亡检测使用AnncxinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒，4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，收集细胞后加入1×Binding Buffer重悬细胞，在加入AnncxinV-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min，上机前5 min再加入PI染色。

2.6 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测Akt、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、caspase3、cleaved-caspase3、CytC蛋白表达 实验分为正常组(5.5 mmol/L)、高糖组(35 mmol/L)、丹皮酚低剂量组(10 μg/mL)、丹皮酚中剂量组(20 μg/mL)、丹皮酚高剂量组(40 μg/mL)。48 h后弃去原培养液，用PBS洗3遍，每孔加入50 μL裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，冰上裂解30 min，4 ℃、13 500 r/min离心15 min，取上清液。BCA法进行蛋白浓度检测，绘制出标准曲线，取总蛋白30 μg上样。按4∶1混合蛋白液与5×Buffer上样缓冲液，100 ℃ 孵育10 min至蛋白变性。10% SDS-PAGE稳压电泳，冰中150 mA稳流转膜，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜。次日孵育抗体，将膜放于1∶2 000一抗稀释液中室温摇床上孵育2 h，每次用TBST洗膜15 min，共洗3次；加入1∶8 000二抗稀释液，室温摇床上孵育90 min，每次用TBST洗膜10 min，共洗3次；显影暗室中将ECL发光液滴加到载有蛋白的膜上，避光显影。Image J分析条带灰度值，以目的条带灰度值/β-actin 灰度值表示蛋白表达。实验重复3次，取均值。

3 结果

3.1 新生乳鼠原代心肌细胞形态学观察 显微镜下观察心肌细胞刚分离时呈圆形，折光性好，悬浮于培养基中，大概5～6 h后，开始贴壁生长，由圆形逐渐变成梭形；24 h后可见自发搏动，但节律和强度不同，伸出伪足，成梭形或多边形，且胞核清晰；48 h后互相交织成网，形成细胞簇；72 h后收缩力明显且搏动呈现同步性，心肌细胞增殖和分裂甚少。见图1。

注：A为200倍，B为400倍。图1 72 h不同倍数下心肌细胞形态学观察

3.2 药物筛选 丹皮酚终质量浓度为40 μg/mL时，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)，故以其为最大安全质量浓度。见表1。

3.3 心肌细胞凋亡率检测 与正常组比较，高糖组细胞的凋亡率升高(P<0.01)；与高糖组比较，丹皮酚低、中、高剂量组细胞凋亡率降低(P<0.01)，其中丹皮酚中、高剂量组细胞凋亡率下降明显(P<0.01)，见图2、表2。

表1 丹皮酚安全用药浓度筛选结果

图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

表2 各组细胞凋亡率比较

3.4 Akt、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、caspase3、cleaved-caspase3、CytC蛋白表达检测 与正常组比较，高糖组细胞Akt、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，Bax、cleaved-caspase3、CytC蛋白表达升高(P<0.05，P<0.01)，caspase3蛋白表达无明显变化(P>0.05)；与高糖组比较，丹皮酚低、中、高剂量组细胞Akt、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达升高(P<0.05，P<0.01)，Bax、cleaved-caspase3、CytC蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，呈一定的剂量依赖性；caspase3的蛋白表达在各用药组中均无明显变化(P>0.05)。见图3～8。

注：与正常组比较，**P<0.01；与高糖组比较，#P<0.05，##P<0.01。图3 心肌细胞Akt的蛋白表达

注：与正常组比较，*P<0.05；与高糖组比较，##P<0.01。图5 心肌细胞Bcl-xL的蛋白表达

注：与正常组比较，**P<0.01；与高糖组比较，#P<0.05，##P<0.01。图6 心肌细胞Bax的蛋白表达

注：与正常组比较，**P<0.01；与高糖组比较，##P<0.01。图7 心肌细胞cleaved-caspase3 的蛋白表达

注：与正常组比较，**P<0.01；与高糖组比较，#P<0.05，##P<0.01。图8 心肌细胞CytC的蛋白表达

4 讨论

糖尿病心肌病已经成为糖尿病致死的主要原因[8]。心肌细胞凋亡是重要发病环节。研究提示，高血糖可通过影响线粒体功能诱导程序性细胞死亡[9-10]。因此，抑制心肌细胞凋亡可减轻糖尿病心肌病对心肌组织的破坏。本研究经流式细胞术法检测，结果显示，与正常组比较，高糖组心肌细胞凋亡率升高(P<0.01)；与高糖组比较，丹皮酚各剂量组心肌细胞凋亡率降低(P<0.01)，且呈现一定的剂量依赖性，表明丹皮酚能够通过抑制心肌细胞凋亡而对高糖损伤的心肌细胞产生保护作用。

高糖环境下，会产生大量的糖期终末化产物、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶等激活细胞的凋亡机制，诱导细胞的异常凋亡。细胞凋亡包括凋亡抑制蛋白和凋亡诱导蛋白等多种蛋白联合作用[11]。目前，多种因子被证明与心肌细胞的凋亡有关，其中Akt是其中之一[12]。以Akt基因敲除小鼠为研究对象，发现胰岛素β细胞数目减少，且外周组织中出现了胰岛素抵抗，早期出现心肌细胞的凋亡，导致2型糖尿病的发生[13-14]。在2型糖尿病胰岛素严重抵抗的患者体内，也检测出了Akt基因的突变，说明激活PI3K-Akt 信号通路将成为防治糖尿病心肌病心肌细胞凋亡的一个关键环节[13]。

线粒体凋亡通路是最主要的凋亡通路[14]，Bax在细胞质中以一种非活化的形式存在，在接收到凋亡信号后Bax移位到线粒体表面，破坏线粒体膜，增加线粒体通透性，致使细胞色素C外泄，线粒体凋亡途径被激活，此凋亡途径也可被Bcl-2、Bcl-xL等凋亡抑制蛋白所调控[15]，Bax与Bcl-2结合形成异源二聚体，可以阻止Bax向膜外移位，从而抑制其促凋亡的作用。caspase3作为凋亡的最终执行者，正常情况下以无活性的酶原形式存在，Akt一旦被激活发生凋亡级联反应，caspase3被剪切活化为cleaved-caspase3，故抑制cleaved-caspase3的活化也能抑制细胞凋亡[16-18]。

本实验经Western blot检测，结果显示，丹皮酚可抑制心肌细胞凋亡，增强Akt表达，激活PI3K-Akt信号通路，通过上调抗凋亡蛋白Akt、Bcl-2、Bcl-xL的表达，抑制促凋亡蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、Bax、cleaved-caspase3、CytC的表达而实现，且呈现一定的剂量依赖性。

高糖环境下的心肌细胞，Akt激活障碍，PI3K-Akt信号通路传导受限，致使促凋亡基因Bax、CtyC表达上调，抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL表达受到抑制，诱导心肌细胞凋亡增强。经丹皮酚干预后，Akt表达增强，抑制了其下游促凋亡蛋白Bax、CtyC的表达，阻碍了caspase3的活化，同时促进抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL表达，心肌细胞凋亡程度明显减轻，使高糖损伤的心肌细胞得到了保护。

综上所述，丹皮酚有效抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡，可能是通过激活PI3K-Akt信号通路，促进抗凋亡基因蛋白的表达，抑制促凋亡基因蛋白表达，阻碍caspase-3的活化，显著降低心肌细胞凋亡程度，从而保护高糖损伤的心肌细胞。