小柴胡汤抗慢性乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的机制研究

凌慧，侯恩存，赵艺蔓，陈晓宇，李洲强，郭凯凯，覃凤飞

广西中医药大学附属瑞康医院 广西南宁 530000

我国肝癌病人占全球的半数以上并不断呈上升趋势[1]，其主要由75%～85%的肝细胞癌（HCC），10%～15%的肝内胆管癌（iCCA）和其他两种罕见的组织病理学类型组成。当前，HCC的危险因素包含乙型肝炎病毒（HBV）等病毒感染，烷基化剂等化学致癌物，X射线等物以及饮酒、吸烟、熬夜等生活方式和新陈代谢异常影响肿瘤微环境的2型糖尿病等[2]。深入阐明慢性HBV相关HCC发展和转移的分子机制，在其预防、诊断和治疗具有重要临床意义。

现代研究表明[3]，小柴胡汤可通过抑制肝脂质过氧化和细胞外基质的积聚，从而起到护肝强肝之效，临床已被广泛应用于肝炎、肝癌等疾病。但因小柴胡汤化学成分复杂，目前对于小柴胡汤治疗肝癌完整的药效机制尚未明确。

本研究基于网络药理学，加以生物信息学、分子对接等手段，探索有效物质成分、核心作用靶点以及其调控的生物学机制，从而揭示的小柴胡汤抗HBV相关HCC的药效基础及理论依据。

资料与方法

1 小柴胡汤活性成分筛选及作用靶点

在TCMSP平台检索小柴胡汤诸味中药的活性成分和相关靶点。限制OB≥30%，DL ≥0.18，符合里宾斯基的类药五原则[4]，更能与人体组织器官结合以发挥中药药效[5]。

2 芯片数据检索及差异基因分析

在 GEO 数据库以“liver cancer”、“hepatocellular carcinomas”、“HCC”等为关键词检索，选出基因芯片GSE121248数据集，使用R软件limma包对数据进行标准化、差异分析（限制LogFC绝对值＞1且调整adjustP＜0.05）。

3 构造小柴胡汤抗HBV相关HCC的“中药活性成分-药物-疾病靶标”网络图

将1及2步骤获得的结果合并取交集基因，导入到 cytoscape3.7.2 中网络分析，根据node、edge情况构造“中药活性成分-药物-疾病靶标”网络图。

4 拓扑网络构建

使用cytoscape3.7.2的BisoGenet插件里收录的DIP，BIOGRID，HPRD，INTACT，MINT和BIND等蛋白数据库来构建PPI。采用CytoNCA插件结合中介性和连通性等指标整合网络拓扑结构分析，设定条件DC＞61，BC＞200，找出药物作用于 HBV 相关 HCC 的重要基因。

5 基因本体论（GO）功能富集分析

使用R包输入条件pvalueCutoff ＜0.05，且调整qvalueCutoff＜0.05对交集基因进行GO注释。

6 京都基因百科全书数据（KEGG）通路富集分析

使用R软件输入条件pvalueCutoff＜0.05，且调整qvalueCutoff＜0.05对交集基因进行KEGG通路分析。

7 通路与基因网络图绘制

将上述6结果导入到 cytoscape3.7.2 中，显示通路与基因的富集程度，制作肝癌通路与基因表、肝癌通路与基因网络图。

8 药物成分-核心靶点分子对接验证

筛选出重要成分与核心靶点进行分子对接验证。分别从PubChem、PDB平台下载活性成分结构mol2文件、核心基因蛋白PDB文件。利用PyMOL 2.3.4去除水分子及配体，导入AutoDock1.5.6软件加氢，将活性成分及靶蛋白格式保存为pdbqt格式，设置盒子参数对受体和配体进行分子对接，采用Pymol 2.3.4软件对结果可视化。

结 果

1 有效成分筛选及靶点预测

TCMSP网站得到小柴胡汤的活性有效成分共149个（见表1），其中对应柴胡11个，半夏9个，黄芩29个，人参13个，生姜3个，大枣16个，甘草88个，共有活性成分8个。同时获取小柴胡汤各味中药成分的所有靶点共12048个，其中柴胡的靶点2737个，半夏的靶点1302个，黄芩的靶点1203个，人参的靶点746个，生姜的靶点2225个，大枣的靶点1329个，甘草的靶点2506个。将筛选后的活性有效成分及所有药物靶点取交集，最终整理得小柴胡汤活性有效成分药物靶点3560个。

表1 小柴胡汤的部分活性有效成分

2 差异基因分析

与健康组对照，HBV相关HCC患者580个基因存在差别表达，上调基因167个，下调基因413个。绘制出热图（见图1a）及火山图（见图1b）。

3 构造“中药活性成分-药物-疾病靶标”网络图

将小柴胡汤与HBV相关HCC的差异基因合并，获得30个交集基因（见图1c）。将交集基因、化学成分导入到 cytoscape3.7.2 中，构造“中药活性成分-药物-疾病靶标”网络图（见图1d），度值最高的是柴胡、甘草、大枣都具有的活性成分槲皮素（quercetin，MOL000098），其次是山奈酚（kaempferol，MOL000422）、豆甾醇（Stigmasterol，MOL000449）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，MOL000358）等，故可认为上述成分是小柴胡汤抗HBV相关HCC的主要分子。

图1 a正常人与HBV相关HCC患者差异基因热图；b正常人与HBV相关HCC患者差异基因火山图；c小柴胡汤药物与疾病靶标韦恩图；d中药活性成分-药物-疾病靶标网络

4 拓扑网络

PPI拓扑分析筛选出3个标红的CDK1、TOP2A、HSPB1重要基因，见图2。

图2 小柴胡汤治疗HBV相关HCC基因的拓扑网络

5 GO富集分析

GO分析共获得278个功能富集条目，其中BP250条、CC4条、MF24条，分别选前20条富集条目绘制气泡图（见图3a～3c）。其中BP主要富集在类固醇代谢；CC则集中在蛋白激酶全酶复合物；MF首要表示在氧化还原酶活性。

6 KEGG富集分析

KEGG剖析共获取18条通路（图 3d），通路涉及类固醇激素的合成通路，视黄醇、药物、花生四烯酸等代谢通路，细胞衰老通路，p53、IL-17、TNF等信号通路。

图3 a 生物过程（BP）；b 细胞成分（CC）； c分子功能（MF）；d KEGG；e 通路与基因网络图

7 通路与基因网络图绘制

从肝癌通路与基因表（表2）、网络图（图3e）中可以看出可以看出 hsa00830、hsa00982、 hsa00980 、hsa05204、hsa04218是富集最多的通路，FOS、 CCL2、CDK1、CCNB1、 ADH1C、PTGS2、CXCL2、CYP2B6是显著表达的基因。

表2 小柴胡汤治疗HBV相关HCC通路

8 分子对接结果

上述显示，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇是小柴胡汤有效活性成分中degree预测靶点最多的关键药效物质，CDK1、TOP2A、PTGS2、FOS、CCL2是关键的候选基因，且经“中药有效成分-药物靶点”网络图得知活效成分与关键基因存在相互作用，故选取两者分别作为分子对接的配体和受体进行分子对接验证，以探究二者分子层面的相互作用位点。普遍认为，对接结合分值小于-4.25 kcal·mol-1表示两者间有一定的结合活性，小于-5.0则表示有较好的结合活性，小于-7.0 更具备强烈的结合活性[6]。通过autodock软件进行分子对接并计算出结合能（见表3），对接结果利用 Pymol 软件绘图，见图4。

图4 分子对接

表3 小柴胡汤抗HBV相关HCC相关分子对接结合信息

讨 论

虽然小柴胡汤在临床肝癌上运用较多，本研究探讨其治疗的分子靶点及机理，以进一步促进临床运用与相关实验研究。

1 潜在有效成分

小柴胡汤的首要活性成分槲皮素，可以通过上皮间充质转化（EMT）延缓肝癌HepG2细胞的增殖[7]，还可以通过抑制PKC、PTK、MAPK和其他信号通路来增加癌细胞对药物的敏感性[8]。山柰酚激活TP53通路或结合雌激素受体，从而产生抗肿瘤作用[9]。豆甾醇在临床实验过表达调亡基因的情况下，破坏肿瘤血管的生成，具有抑制肝癌、皮肤癌等多种肿瘤生长的作用[10]。植物甾醇类β-谷甾醇不仅具有抗炎、抗氧化作用，还具有抗病毒、调免疫、抗肿瘤的作用[11]，其抗肿瘤机制涉及诱导细胞周期停滞与调亡，抑制肿瘤细胞对机体的黏附和侵入[12]。上述四种化合物均处于网络图的核心，并具有较高Degree，提示这些化合物可能在小柴胡汤抗HBV相关HCC过程中起主要作用。

2 潜在基因靶标

CDK1，亦称CDC2，是一种主要参与有丝分裂细胞周期过程的丝氨酸/苏氨酸激酶，通过去磷酸化激活参与调节细胞周期中S期及G2/M期[13]，若该过程运行显著异常，会导致肿瘤细胞不断的增殖扩散以及受损细胞的不恰当存活[14，15]。此外，CDK1在miR-1271-5p[16]、miR-378[17]靶向下抑制凋亡、增殖并加强放射敏感性。据研究报道，能抑制肿瘤增殖的CDKs抑制剂[18]是医治肿瘤的新兴领域之一。

TOP2A是一类参与改变DNA拓扑状态、编码Topllα蛋白DNA片段的酶蛋白，在肝癌组织高表达，且与临床预后显著负相关[19]。通过参与p53、癌症和细胞凋亡信号传导等多种途径， 发挥原癌基因作用[20]，并对化疗药物蒽环类的疗效具有预测性[21]。

FOS编码的C-fos蛋白是AP-1的一个单体，AP-1通过JNK途径被各种促炎性刺激物激活，进而影响细胞增殖凋亡等过程[22]。AP-1复合物亚基mu-1（AP1M1）在HBV转染的HepG2肝癌细胞中被上调， 加速了蛋白激酶B的磷酸化和HepG2肝癌细胞增殖，是与HBV感染引起的肝癌进展有关的关键因素之一[23]。

CCL2 是活化炎症、血管生成和抗凋亡的关键介质，参与JAK2-Stat5和p38MAPK通路，增加血管内皮细胞的通透性，促进癌细胞转移[24]。

PTGS2是一种易被多种因素（如炎症损伤、激素水平、致癌剂）诱导表达的即刻反应癌基因[25]，通过催化花生四烯酸释放炎症介质前列腺素[26]。

CCNB1，亦称Cyclin B1，是一种调节细胞周期G2/M阶段的有丝分裂调节蛋白，将其敲除或在miR-144靶向调节下抑制表达可延缓肿瘤的形成[27]。

3 富集分析

KEGG通路主要与细胞凋亡、转移、炎症和免疫相关。大量文献报道，显著富集的P53信号通路与细胞周期、DNA修复改变紧密相关，影响肝癌的发生发展[28]。持续慢性细胞衰老参与肿瘤的发生，衰老肝细胞的蓄积和其免疫防御受损所导致的衰老共存将向着HCC的方向发展[29]。IL-17信号通路与自身免疫病、自身免疫防御、调节感染、活化炎症反应等相关[30]，另一个富集显著的TNF信号通路涉及到下游NF-κB激活的传导途径[31]，参与基因转录、细胞增殖、血管生成、肿瘤侵袭转移和氧化应激[32]。

4 分子对接

小柴胡汤中关键药效物质与核心靶点蛋白能够稳定的结合，表明小柴胡汤可能作用于 CDK1、CCNB2、 TOP2A 、FOS、 PTGS2、 CCL2 等靶点，调控细胞增殖和凋亡，调节免疫活性，从而抗肝癌。研究表明[33]，黄酮类化合物可以直接或间接地降落CDKs和cyclins的蛋白水平。这与本研究中“有效活性成分-药物靶点网络”的槲皮素、山奈酚与CDK1、CCNB2中互相作用的观点相一致。

综上所述，本研究通过联合网络药理学分析与分子对接验证，发现槲皮素、山柰酚为小柴胡汤的主要活性成分，以 CDK1、TOP2A、FOS、 CCL2 、CCNB1等为核心靶标，涉及代谢合成、蛋白丝氨酸-苏氨酸激酶活性、氧化结合调控等多个生物过程，并通过调控细胞周期、合成代谢、免疫炎症信号通路发挥抗HBV相关HCC，本研究最终通过分子对接验证了活性成分与核心靶标之间的协同抗癌效应，为后续分子层面的中药抗癌研究提供理论支持。