沉默miR-107对乳腺癌细胞侵袭及上皮-间质转化的影响

代云峰 曹春姚 李昂 任明 魏环兵 贾翠英 郎尉雅 李鹏辉 鲍红光 刘云龙 张旭东 潘洪明

(齐齐哈尔医学院 1附属第二医院 检验科,黑龙江 齐齐哈尔 161006;2附属第二医院心血管内五科;3基础医学院;4附属第二医院胸外科；5附属第二医院信息中心)

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，乳腺癌的晚期转移已经成为该类肿瘤预后效果差的主要因素〔1～3〕。在乳腺癌发生和发展的过程中，癌细胞受到细胞内遗传因素和细胞外肿瘤微环境的复杂调控。这些调控因素一方面通过影响细胞周期、DNA损伤修复等影响细胞的增殖活性，另一方面也通过调控细胞的迁移和侵袭能力影响肿瘤细胞的转移〔4〕。研究表明，肿瘤细胞的上皮-间质转化(EMT)是肿瘤转移的重要步骤〔5，6〕。在EMT的过程中，细胞表面E-钙黏蛋白(Cadherin)、N-Cadherin、波形蛋白(Vimentin)等表达上调，细胞连接和细胞极性丧失，细胞失去上皮细胞形态，转而呈现间质细胞形态，并获得迁移和侵袭能力〔7〕。

部分微小RNA(miRNA)对乳腺癌细胞的EMT发挥了重要的调控作用〔8〕，如miR-200可以通过靶向E盒结合锌指蛋白(ZEB)调控多种恶性肿瘤细胞的EMT〔9，10〕。miR-107是一类非保守miRNA，被发现参与调控结胰腺癌EMT的过程〔11〕，然而其在乳腺癌中的作用还了解不多。为此，本文探究了miR-107对乳腺癌细胞系T47D、MDA-MB-231迁移和EMT的影响。

1 材料与方法

1.1试剂 对照miRNA和miR-107抑制物在广州锐博公司合成。培养细胞所需的DMEM培养基、RPMI1640培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)LipofectmineRNAi Max购自美国ThermoFisher公司；细胞总RNA提取试剂盒、莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV)逆转录酶和qPCR SuperMix购自全式金生物科技有限公司；Transwell培养小室购自Millipore公司；抗磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化(p)-AKT抗体购自美国CST公司，辣根过氧化物酶耦联的二抗购自美国SantaCruz公司。

1.2细胞培养和转染 正常乳腺组织细胞系Hs578Bst和乳腺癌细胞系MCF7、HS578T、T47D和BT-549购自中国医学科学院细胞库。其中Hs578Bst、HS578T和MCF7细胞系培养在90% DMEM+10%FBS培养基中，T47D和BT-549细胞使用90% RPMI1640+10%FBS进行培养。细胞分为3组：空白转染组、对照miRNA组和miR-107抑制剂组。对照miRNA和miR-107的转染：取2个1.5 ml离心管中加入100 μl Opti-MEM培养基，随后分别加入5 μl miRNA和5 μl转染试剂，室温静置5 min后，混合并轻轻混匀，继续静置5 min后加入细胞培养基中。转染6 h后更换新培养基。

1.3实时荧光定量PCR 离心收集细胞，并用PBS清洗一遍，按照RNA提取试剂盒操作说明进行总RNA提取。提取得到的总RNA用焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O溶解，并调整浓度为0.5 μg/μl。随后使用M-MLV逆转录酶进行cDNA合成。首先将总RNA与18寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核酸〔Oligo(dT)18〕引物混合，65℃变性5 min，后立刻冰浴退火2 min。随后在反应体系中加入脱氧核糖核苷酸(dNTPs)、M-MLV、核酸酶抑制剂，放置在PCR仪中42℃反应30 min，得到的产物即为cDNA模板。随后使用实时荧光定量PCR混合物进行目的基因mRNA表达水平的检测。反应体系首先经过95℃预变性30 s，随后利用95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s的反应扩增40个循环，最后加入解离程序检测溶解曲线。通过ΔΔCt计算得到目的基因与内参基因GAPDH相对表达水平，所用引物：E-cadherin正义链：5′-ACAGCACGTACACAGCCCTA-3′，反义链：5′-GCAGAAGTGTCCCTGTTCCAG-3′；Vimentin正义链：5′-AGCCGAAAACACCCTGCAAT-3′，反义链：5′-CGTTCAAGGTCAAGACGTGC-3′；Twist1正义链：5′-GGCACCATCCTCACACCTCT-3′，反义链：5′-GCTGA-TTGGCACGACCTCT-3′；N-cadherin正义链：5′-ATTGGACCATCACTCGGCTTA-3′，反义链：5′-CACACTGGCAAACCTTCACG-3′；GAPDH正义链：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反义链：5′-TGGTGA-AGACGCCAGTGGA-3′；miR-107正义链：5′-CATACTAGTGTCTTCTGGACAGGCTCTG-3′，反义链：5′-CTTAAGCTTA-GAATCTCTCACATACACAC-3′。

1.4细胞划痕试验 将细胞接种于6孔培养板中，待细胞贴壁后分别转染对照miRNA和miR-107模拟物，转染6 h后换液，使得细胞继续呈单层贴壁生长状态直至细胞汇合度达到80%～90%。用1 ml移液器枪头在孔板底部划一条直线，随后在于第一条直线垂直的方向划一条相交的直线。划线完成后，用PBS清洗2次，去除脱落的细胞，随后加入新鲜培养基。在划线后0 h和24 h用倒置相差显微镜对同一划线位置进行拍照，并用Image J软件测量划痕面积(S)，则24 h时细胞迁移率=(S0 h-S24 h)/S0 h×100%。

1.5细胞侵袭实验 将正常传代培养的细胞接种于6 cm细胞培养皿中，待细胞贴壁后分别转染对照miRNA和miR-107抑制物，转染6 h后更换无血清培养基，饥饿处理24 h。随后用胰蛋白酶消化细胞，并离心用PBS清洗1次，用无血清培养基重悬并调整细胞密度为5×105个/ml。取200 μl细胞接种于预先包被基质胶的Transwell培养小室中，并将小室放置在含有10% FBS完全培养基的24孔细胞培养板中，与37℃ CO2培养箱中培养24 h。随后取出Transwell小室，用棉签拭去小室内的基质胶和细胞，并用4%甲醛溶液固定10 min。随后用0.1% 结晶紫溶液对迁移至小室底部的细胞进行染色10 min，在体视显微镜下对染色后的小室底部细胞进行拍照，并用Image J软件统计单位面积上的细胞数目。

1.6蛋白质免疫印迹实验 转染对照miRNA或miR-107模拟物的细胞经过消化、离心收集后，用PBS重悬细胞，并用冰浴超声的方式对细胞进行裂解。细胞裂解液经过4℃，12 000 r/min离心去除细胞碎片，收集上清加入5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，100℃水浴加热10 min，得到变性的全细胞蛋白样品。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对蛋白样品进行分离，随后将蛋白样品转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。使用5%的脱脂牛奶在室温封闭带有蛋白样品的PVDF膜，随后加入一抗稀释液，室温孵育1 h，再加入二抗稀释液，室温孵育45 min。最后PVDF膜经过漂洗后，加入化学反光底物对膜上蛋白进行显色，并使用凝胶成像仪获取蛋白条带信息。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1miR-107在乳腺癌细胞系中表达 与正常乳腺组织细胞Hs578Bst(1.00±0.00)相比，miR-107在乳腺癌细胞系HS578T(2.79±0.34)、MCF7(1.49±0.22)、T47D(1.86±0.41)和BT549(1.22±0.12)中表达水平均显著上升(t=9.002、9.002、3.762、3.606，P<0.001,P<0.05)。

2.2沉默miR-107对乳腺癌细胞系HS578T迁移的影响 空白转染组细胞迁移率为(71.46±6.89)%。与对照miRNA组相比，miR-107抑制剂组细胞迁移率明显降低〔(69.13±5.77)% vs (54.84±6.25)%,t=3.315,P<0.05〕，表明沉默miR-107可以抑制乳腺癌细胞的迁移。

2.3沉默miR-107对乳腺癌细胞系HS578T侵袭能力的影响 空白转染组细胞侵袭数为(32.3±4.9)个。与对照miRNA组相比，miR-107抑制剂组侵袭细胞数明显减少〔(30.8±4.7)个 vs (23.5±5.4)个，t=2.884，P<0.05〕。见图1。

图1 结晶紫染色显示各组侵袭到下室的HS578T细胞(×100)

2.4沉默miR-107对乳腺癌细胞系EMT的影响 与对照miRNA组相比，miR-107抑制剂组HS578T细胞中E-cadherin mRNA表达水平显著下降，而N-cadherin、Vinmentin和Twist的mRNA表达水平上调(P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.5沉默miR-107对乳腺癌细胞系HS578T PTEN/AKT信号通路的影响 与对照miRNA组相比，miR-107抑制剂组24 hHS578T细胞中PTEN蛋白的表达水平明显下调(0.98±0.16 vs 0.45±0.11；t=4.728，P<0.05)，而磷酸化(p)-AKT的水平则明显上升(0.34±0.07 vs 0.68±0.09；t=5.165，P<0.05)，见图2。表明miR-107通过PTEN调控了AKT信号通路。

图2 蛋白质免疫印迹实验检测各组细胞PTEN、p-AKT表达水平

3 讨 论

miRNAs在调控肿瘤细胞的增殖、迁移、浸润等方面发挥了重要的作用，部分miRNAs中肿瘤组织中的表达水平与疾病的恶性程度和预后有明显的相关性〔12，13〕。miR-107已经被发现在胃癌〔14〕、肝癌〔15〕、胰腺癌〔16〕等多种恶性肿瘤组织中表达水平呈现异常，而这种异常的表达很可能跟肿瘤的发生和转移密切相关。下调miR-107的表达也会影响多种肿瘤细胞的增殖、迁移等过程〔17〕。在乳腺癌组织中也发现了miR-107表达水平的上调，其表达水平与乳腺癌的淋巴转移有明显相关性〔18〕，但miR-107对乳腺癌疾病发展的调控作用还不是特别清楚。

本研究发现，沉默miR-107的表达显著抑制乳腺癌细胞系的迁移和侵袭能力。肿瘤细胞的EMT是指肿瘤细胞失去上皮细胞形态，而转变为间质细胞类型，伴随这一过程往往会让肿瘤细胞获得侵袭和转移的能力。EMT一个重要特点是细胞间的连接减少，细胞膜蛋白E-cadherin表达水平下调，而N-cadherin的表达水平上升，此外，发生EMT的细胞中也会出现Vinmentin及相关转录因子Twist表达水平的上升〔6〕。本研究说明沉默miR-107促进了乳腺癌细胞EMT的过程。因此miR-107对乳腺癌细胞侵袭能力的影响很可能是通过对其EMT过程的调控实现的。

miR-107在多种肿瘤中通过调控不同的靶蛋白发挥不同的作用。在宫颈癌细胞中，miR-107通过靶向髓样细胞白血病(MCL)1调控共济失调-毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)/细胞周期检验点激酶(Chk)1信号通路，并影响细胞侵袭〔19〕；在胃癌细胞中，miR-107则靶向神经纤维瘤蛋白(NF)1和DICER1调控胃癌细胞的侵袭和转移〔20，21〕，影响疾病进展；在肝癌细胞中，miR-107被发现可以靶向Axin2蛋白〔22〕。miRNA对底物蛋白的调控作用通常是通过与其mRNA结合，影响mRNA的稳定性及其转录活性，进而影响下游蛋白的表达。此外，有研究表明，miR-107可以直接靶向EMT关键调节蛋白PTEN〔11〕。本研究也发现，在乳腺癌细胞HS578T中，沉默miR-107同样可以抑制PTEN蛋白的表达，进而促进细胞AKT的磷酸化修饰。综上所述，在乳腺癌细胞系中表达水平显著上升，而沉默miR-107的表达则可以通过靶向PTEN/AKT信号通路，促进细胞EMT，影响乳腺癌细胞的迁移和侵袭。提示miR-107不仅可以作为肿瘤标志物，也可能作为新的药物作用靶点用于乳腺癌的临床治疗中。