Fscn1基因在NSCLC中的表达、生物学功能信号通路富集及其与患者预后的关系

任敬 陈谦 许建新 杨新宇 吴琦

(天津市泰达医院 1呼吸内科，天津 300457；2神经外科；3天津医科大学总医院神经外科；4天津大学海河医院呼吸与危重症医学科)

肺癌是临床上最为常见的恶性实体肿瘤，其发病率在男性为第一位，女性为第二位，且死亡率位居所有肿瘤的第一位〔1〕。根据病理类型，肺癌大体分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC约占所有肺癌的80%〔2〕。大部分NSCLC患者就诊时已发展为晚期或局部晚期，失去根治手术的时机因而预后较差。然而，NSCLC的发病机制仍然不明，其患者预后相关因素并不完全清楚。近年来随着高通量测序等分子生物技术的不断发展，从分子角度探寻NSCLC发病机制及预后相关生物学标志物成为研究热点。肌动蛋白结合蛋白(Fscn)1基因定位于人7号染色体，其生物学功能主要与细胞迁移有关〔3〕。Fscn1基因编码蛋白在人多种实体肿瘤组织中呈现高表达，如肠癌、肝癌、前列腺癌等，并与患者的临床病理特征存在一定的关系〔4～6〕。但Fscn1基因在NSCLC中的表达、生物学功能及其与患者预后关系研究鲜有报道。本研究主要探讨Fscn1基因在NSCLC中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1Fscn1基因mRNA在肿瘤及对应正常组织中的表达 在人类肿瘤基因组(TCGA)数据库中检索“肺癌”“非小细胞肺癌”和“Fscn1基因”，检索物种为人类，比较多种人肿瘤组织和对应正常组织中Fscn1基因mRNA的表达水平，存在差异的条件为基因差异表达大于2倍(|Log2FC|>1)，P<0.05〔7〕。

1.2功能富集和蛋白网络分析 采用基因本体论(GO)对Fscn1基因和相关蛋白进行功能富集，包括细胞组分、分子功能和生物学过程3个层面〔8〕。同时利用STRING数据库构建相互作用蛋白网络构建条件为置信度大于0.5〔9〕。

1.3生存分析 根据Fscn1基因在NSCLC患者癌组织中表达的中位数，分为高、低表达组，分别计算高、低表达组生存期并绘制生存曲线(Kaplan-Meier)，采用Log-Rank检验分析比较高、低表达组与患者预后的关系。比较总生存期(OS)和无疾病进展生存期(DFS)在Fscn1基因高低表达组间是否存在差异。

1.4免疫组织化学法 回顾性分析天津市泰达医院收治的NSCLC患者51例，采用免疫组织化学法检测患者手术标本中NSCLC患者癌组织和癌旁正常组织中Fscn1基因编码蛋白表达水平，分析比较Fscn1基因编码蛋白表达与患者临床病理特征的关系。免疫组织化学检测Fscn1基因编码蛋白表达按试剂盒操作说明进行。在高倍镜下随机选取5个视野，根据着色强弱和阳性细胞比例综合判定Fscn1表达强度。按色强度评分：不着色(0分)、浅黄(1分)、棕黄(2分)、棕褐色(3分)；按照每高倍镜(SP，×200)下阳性细胞所占的比例分为<10%(0分)、10%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)及>75%(4分)。总体评分值=阳性细胞比例评分×染色强度评分；最终评判：<6分为低表达，≥6分为高表达。低表达率(%)=低表达例数/总例数×100%。高表达率=高表达例数/总例数×100%。

1.5统计分析 应用STATA12.0统计软件进行t检验、χ2检验、Log-Rank检验。

2 结 果

2.1Fscn1在NSCLC和其他肿瘤中的表达 与正常肺组织比较，Fscn1基因mRNA在多种肿瘤中表达水平明显升高，见图1A；在肺鳞癌患者中，癌组织中Fscn1基因mRNA表达水平显著高于正常肺组织(P<0.05)，见图1B；进一步分析显示，NSCLC不同临床分期患者Fscn1基因mRNA表达水平存在明显差异 (P<0.05)，见图1c。

1)P<0.05A:Fscn1基因mRNA在多种肿瘤及对应正常组织中的表达；B Fscn1基因mRNA在肺腺癌和鳞癌及对应正常组织中的表达；C:Fscn1基因mRNA表达与NSCLC患者临床分期的关系BLCA:膀胱尿路上皮癌；BRCA:乳腺浸润癌；CESC:宫颈鳞癌和腺癌；CHOL:胆管癌；COAD:结肠癌；ESCA:食管癌；GBM:多形成性胶质细胞瘤；HNSC:头颈鳞状细胞癌；KICH:肾嫌色细胞癌；KIRC:肾透明细胞癌；KIRP:肾乳头状细胞癌；LIHC:肝细胞肝癌；LUAD:肺腺癌；LUSC:肺鳞癌；PAAD:胰腺癌；PRAD:前列腺癌；PCPG:嗜铬细胞瘤和副神经节瘤；READ:直肠腺癌；SARC:肉瘤；SKCM:皮肤黑色素瘤；THCA:甲状腺癌；THYM:胸腺癌；STAD:胃癌；UCEC:子宫内膜癌图1 Fscn1基因mRNA在NSCLC和其他肿瘤中表达

2.2Fscn1基因编码蛋白相互作用网络 与Fscn1基因编码蛋白相互作用较为紧密的蛋白网络共有节点数共51个，相互作用关系446个，区域聚类指数为0.75，蛋白相互作用网络富集显著(P<0.05)。见图2。

图2 与Fscn1蛋白相互作用网络

2.3功能富集

2.3.1Fscn1基因生物学过程富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白生物学过程主要富集于核小体组装，间充质细胞迁移和胸腺细胞凋亡等，见图3。

图3 生物学过程富集气泡图

2.3.2Fscn1基因细胞成分富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白细胞主要富集于核小体、肌球蛋白束和肌动蛋白等，见图4。

图4 细胞成分富集气泡图

2.3.3Fscn1基因分子功能富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白细胞主要富集于 ATP酶活性、黏附链接、蛋白结合等，见图5。

图5 分子功能富集气泡图

2.3.4Fscn1基因相关信号通路富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白KEGG信号通路主要富集于细胞间紧密连接、胰腺肿瘤和上皮细胞侵袭等，见图6。

图6 KEGG信号通路富集气泡图

2.4相关分析 相关性分析显示，Fscn1基因正相关表达最显著的基因为SPHK1基因(r=0.53);于Fscn1基因负相关表达最显著的基因为跨膜蛋白(TMEM)125(r=-0.38)，见图7。

A:正相关表达基因SPHK1;B:负相关表达基因TMEM125 图7 Fscn1基因相关表达基因散点图

2.5生存分析 根据Fscn1基因mRNA在NSCLC患者癌组织中表达的中位数分为高低表达组，生存分析显示高低表达组总生存(HR=1.3,P<0.05)显著低于低表达组；但高低表达组患者无疾病进展生存无明显差异(HR=0.82,P>0.05)，见图8。

图8 Fscn1 mRNA在NSCLC患者中表达与患者生存期关系

进一步根据病理类型分为鳞癌和腺癌，结果显示肺腺癌中，Fscn1基因mRNA高表达患者总生存期显著低于低表达者(HR=1.6,P<0.05)。

2.6Fscn1基因编码蛋白表达情况 Fscn1基因编码蛋白主要表达于肺癌细胞胞质和细胞膜，呈棕黄色颗粒状，弥漫分布于细胞膜及细胞包质内。Fscn1基因编码蛋白在NSCLC患者癌和癌旁组织中的阳性表达率分别为70.6%(36/51)和17.6%(9/51)。Fscn1基因编码蛋白在NSCLC患者癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织(P<0.05)。

2.7Fscn1基因编码蛋白表达与NSCLC患者临床病理特征关系 Fscn1基因编码蛋白在癌组织中的阳性表达与NSCLC患者的临床分期(P<0.05)和纵隔淋巴结转移有关(P<0.05)，见表1。

表1 Fscn1基因编码蛋白表达与NSCLC患者临床病理特征关系(n)

3 讨 论

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤，2018年北美肺癌发病人数23万人，死亡人数为15万人〔10〕。在我国，肺癌是导致居民死亡的重要原因之一，每年因肺癌死亡的人数高达数十万人，肺癌早期起病隐匿，往往在诊断时处于转移性Ⅳ期并伴有远处器官的转移，这导致了患者总生存期缩短，其中脑转移占很大比例〔11〕。然而肺癌的发病原因目前仍未完全明了，大多数研究认为与患者的遗传背景和后天环境因素有关。遗传背景包括恶性肿瘤家族史、某些代谢酶基因多态性等〔12〕，后天因素主要与吸烟、环境污染等因素有关。但肺癌发生的机制十分复杂，其确切发病分子机制仍不完全明了。近年来随着高通量测序等分子生物技术的不断发展，从分子角度探寻NSCLC发病机制及预后相关生物学标志物成为研究热点。

有文献报道Fscn1基因编码蛋白在多种实体肿瘤组织中呈现高表达，如结直肠癌、肝癌、旁观爱等，并与患者的临床病理特征和预后存在一定的关系〔6〕。Fscn1基因编码蛋白是一种细胞骨架蛋白，该基因主要是与F-肌动蛋白结合，并将其组装成平行排列的肌动蛋白束，是调节细胞运动的关键基因之一〔13〕。人类的Fascin基因定位染色体于7p22，编码一个分子量为55 kU的细胞骨架蛋白，Fasci蛋白单体有2个位点可与肌动蛋白结合，每2个单体可倒置形成二聚体，每个二聚体按1∶4比例与肌动蛋白结合，使肌动蛋白形成蛋白纤维间距离为8 nm的有序的平行束结构，该结构有利于加强肌动蛋白细胞骨架以利于抵抗由于细胞迁移时细胞突起运动引起的细胞膜延伸，从而对细胞移动起着重要作用〔14〕。因此，该基因高表达可能与肿瘤细胞的迁移有关。Puppa等〔15〕分析晚期结肠癌患者肿瘤组织中Fscn1基因编码蛋白表达及其与患者临床病理特征及预后关系发现，Fscn1基因高表达与肿瘤的浸润和远处转移有关。

本研究提示Fscn1基因可能在NSCLC的发病中发挥重要作用，其高表达患者远处转移风险可能增加。因此，Fscn1基因在肺癌中表达水平明显上调，且可能参与了肺癌的转移过程。通过靶向一致Fscn1基因表达，有望成为NSCLC治疗的新靶点。