糖尿病肾脏病患者血清let-7d mRNA的相对表达量与肾功能进展的相关性研究

陈映含（赤峰市医院内分泌科，内蒙古赤峰 024000）

糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最为常见的微血管病变，患者肾功能会出现不同程度的受损，若未得到及时有效地治疗最终将发展至终末期肾脏病，目前该疾病已成为终末期肾病的第二大原因，严重威胁患者的健康以及生命[1]。目前DKD 的具体发病机制尚未完全阐明，其主要病理特征为肾小球肥大增生、肾小管基底膜增厚等，进行性肾纤维化是疾病进展的关键病理基础[2]。大量研究证实[3-4]，上皮-间质细胞的转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在DKD患者肾纤维化中发挥着重要的促进作用，在抑制EMT 进程后则可有效缓解疾病进展。let-7d 是let-7家族中的一员，其可通过调控EMT 参与多种恶性肿瘤的发生、发展[5-6]，且有研究显示[7-8]，let-7d 可抑制EMT 防止肺纤维化以及子宫内膜纤维化。目前关于let-7d 与DKD 的相关研究较少，鉴于let-7d可调控与DKD 发病密切相关的EMT，因此我们推测let-7d 可能与DKD 患者的肾功能进展情况有关。本研究分析了let-7d 在DKD 患者血清中的表达情况，并进一步探讨了其与患者肾功能进展的关系，为临床预测DKD患者的肾功能进展提供新的思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年4月～2018年10月在赤峰市医院治疗的DKD 患者164 例。纳入标准：①所有患者均参考《中国成人糖尿病肾脏病临床诊断的专家共识》中的标准进行诊断[9]；②均未并发糖尿病大血管病变；③临床资料以及随访资料完整；④对本次的内容知情同意。排除标准：①1 型糖尿病患者；②并发有肺纤维化、肝纤维化、子宫内膜纤维化等病变的疾病；③并发有恶性肿瘤者；④终末期肾脏病患者；⑤并发其他肾小球疾病、肾结石、急性肾损伤或遗传性肾病；⑥有肾移植史者。所有患者在入组后均进行2年的随访，参考相关文献[10]，若在随访期间发现血肌酐（serum creatinine，SCr）值较基线值翻倍或者肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）较基线值下降30%则认为存在肾功能进展。164 例患者中有10 例随访失联，最后纳入154 例患者进行研究，其中52 例存在肾功能进展，将其纳入到进展组，男性28 例，女性24 例，年龄54.97±8.9岁，体质量指数22.38±2.52 kg/m2；另外102 例无肾功能进展的患者纳入到未进展组，男性59 例，女性43 例，年龄52.89±10.63 岁，体质量指数22.51±3.18 kg/m2。两组的一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本次研究经我院伦理委员会批准同意。

1.2 仪器与试剂日立7600 型全自动生化分析仪（日立公司），DS5 糖化血红蛋白仪（英国DREW SCIENTIFIC 公司），7500 荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司），Trizol 试剂（Invitrogen 公司），逆转录试剂盒（大连宝生生物工程公司）。

1.3 方法 采用实时荧光定量PCR 技术检测let-7d mRNA的相对表达量。抽取所有研究对象的空腹静脉血5ml，采用3 000r/min 的转速离心10min 后提取血清，采用Trizol 试剂提取总RNA，再采用逆转录试剂盒进行逆转录，得到cDNA。以U6 为内参，采用2-△△Ct计算血清中let-7d mRNA的相对表达量。内参U6 上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-A ACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；let-7d 上游引物：5’-AGGTTGCATAGTTTTAGGGCA-3’，下游引物：5’-AAGGCAGCAGGTCGTATAGT-3’。反应条件：94℃ 5min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，重复40 次。每个样本均测量3 次。全自动生化分析仪检测SCr，尿素氮（Urea nitrogen，BUN）、胱抑素C（cystatin C，Cys C）、总胆固醇、三酰甘油等，糖化血红蛋白仪检测糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c），采用氧化酶法检测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）。按照改良的MDRD 公式估算eGFR。采用酶联免疫吸附试剂盒（美国R＆D 公司）检测血清转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的水平。

1.4 统计学分析 使用SPSS22.0 对相关数据进行统计学分析。计量数据均通过正态性检验，以均值±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料以例数或率表示，采用卡方检验。采用Pearson 法分析相关性。采用多因素非条件Logistic 回归进行影响因素的综合分析，采用逐步后退法进行变量的选择和剔除。采用接受者工作特征曲线（receiver operation characteristic，ROC）分析血清let-7d mRNA的相对表达量对DKD 患者肾功能进展的预测价值。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的相关资料比较 见表1。进展组的病程长于未进展组，SCr，BUN，Cys C 和TGF-β1水平均高于未进展组，eGFR，let-7d mRNA 相对表达量均低于未进展组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；两组患者的总胆固醇、三酰甘油、HbA1c，FBG 等指标比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 两组患者的相关资料比较

2.2 DKD 患者肾功能进展的影响因素 见表2。将2.1 中存在差异的病程、SCr，BUN，Cys C，eGFR，TGF-β1 和let-7d mRNA 相对表达量等指标作为自变量，均根据总均值进行分段，转化为两分类变量，≥均值赋值为1，＜均值赋值为0。将DKD 患者是否存在肾功能进展作为因变量，出现肾功能进展值赋值为1，未出现赋值为0。多因素非条件Logistic 回归分析显示，Cys C，TGF-β1水平过高均是DKD 患者肾功能进展的危险因素，而eGFR 和let-7d mRNA 相对表达量水平过高则是DKD 患者肾功能进展的保护因素（P＜0.05）。

表2 DKD 患者的肾功能进展的影响因素

2.3 DKD 患者血清let-7d mRNA 相对表达量与相关指标的相关性 Pearson 分析显示，DKD 患者血清let-7d mRNA 相对表达量与病程无明显的相关性（r=-0.259，P=0.078），与SCr，BUN，Cys C 和TGF-β1均呈负相关（r= -0.302，-0.318，-0.364，-0.494；P=0.013，0.002，0.000，0.000），与eGFR 呈正相关（r= 0.405，P=0.000）。

2.4 血清let-7d mRNA的相对表达量对DKD 患者肾功能进展的预测价值 以进展组患者的血清let-7d mRNA的相对表达量作为阳性样本，以未进展组相关数据作为阴性样本，建立ROC 预测分析模型。结果显示，血清let-7d mRNA的相对表达量对DKD患者肾功能进展的预测价值较高，曲线下面积为0.873（95%CI：0.818～0.928），取最佳截断值1.22时，敏感度为75.00%，特异度为92.16%，准确度为81.10%。ROC 曲线见图1。

图1 血清let-7d mRNA的相对表达量预测DKD 患者肾功能进展的ROC 曲线

3 讨论

据流行病学研究发现[11]，我国成人慢性肾脏病患病率约为12.49%，已成为重要的公共卫生问题，而目前DKD 已经超越肾小球肾炎成为我国住院慢性肾脏病患者的首位病因[12]。除引起肾功能损伤外，DKD 还可导致糖尿病患者发生心血管疾病的风险明显上升，这也是导致患者致死和致残的重要原因[13]。由此可见，DKD 严重影响患者的生命健康，对患者家庭以及社会均造成巨大的医疗负担，如何有效防治DKD 已成为临床重点研究的内容。过往常将一个时间段内SCr 值较基线值翻倍作为肾功能进展的评估依据，但却存在一定的局限性，相关研究发现[10]，无论是基线时eGFR＜60ml/min/1.73m2还是≥60ml/min/1.73m2的患者，2年内eGFR 较基线下降30%的患者后期发生终末期肾病的风险将明显增加。虽然以上标准可较好的筛选出后期进展为终末期肾病的高风险人群，但需要历时2年的随访，若能在筛选出某个基线指标进行合理的预测，则可有效降低工作量。

微小RNA 具有广泛的生物学作用，目前已发现多种微小RNA 在DKD 的发病中起到重要的作用，如miR-21，miR-155 等[14-15]。let-7 家族被广泛研究的微小RNA 家族，共有13 个成员，彭睿等[16]人的研究发现，let-7 家族中的let-7a，let-7d和let-7f 均在DKD 患者血液中呈低表达。本研究结果显示，进展组的let-7d mRNA 相对表达量均低于未进展组，且let-7d mRNA 相对表达量水平过高是DKD 患者的肾功能进展的保护因素，提示let-7d 可能与疾病的发生、发展密切相关。EMT 是DKD 患者肾纤维化的重要病理基础，WANG 等[17]人的研究发现，let-7d 过度表达可下调高迁移率族蛋白A2（high mobility group A2,HMGA2）的表达，进而减轻TGF-β1 诱导的EMT 以及肾纤维化改变，而抑制let-7d 表达则可有效促进肾纤维化。此外，let-7d 也可以通过调控HMGA2的表达抑制肺纤维化以及子宫内膜纤维化[7-8]，可见靶向HMGA2 是let-7d参与纤维化调控的重要机制。Wnt/β-Catenin 信号通路在DKD 的发生、发展中也起到重要作用，XIE等[18]人的研究显示，let-7d 可通过调控β-Catenin的表达参与肺纤维进展，这也可能是其影响DKD肾纤维化的作用机制之一，但还需要相关研究进行验证。RNA 结合蛋白Lin28B 可抑制let-7d的表达，促进肺泡上皮细胞向肌成纤维细胞转换，进而导致增加成纤维细胞胶原合成[19]，另一方面let-7d 也可通过与Lin28B 的3’-非编码区结合抑制Lin28B的表达。LI 等[20]人的研究也证实，miR-379-5p 可通过调控Lin28B/let-7 环路抑制DKD 模型大鼠的肾纤维化进展。由此可见，Lin28B/let-7d 途径可能是DKD 肾纤维化的另一作用机制。本研究相关性分析发现，DKD 患者血清let-7d mRNA 相对表达量与SCr，BUN，Cys C 和TGF-β1 均呈负相关，与eGFR 呈正相关，SCr，BUN，Cys C 和eGFR 均是衡量肾功能的重要指标，该结果进一步说明let-7d的表达与患者的肾功能密切相关，而细胞实验显示[17]，刺激TGF-β1的表达可有效降低肾小管上皮细胞中let-7d的表达，可见二者呈明显的负向调控关系。DKD 在早期多呈隐匿性渐进性进展，肾纤维化是DKD 疾病进展的关键，可敏感地反映患者病情进展的趋势，因此肾纤维化相关指标有作为预测DKD 患者肾功能进展生物标志物的潜力[21]。本研究通过ROC 分析发现，血清let-7d mRNA的相对表达量对DKD 患者肾功能进展的预测价值较高，曲线下面积为0.873（95%CI：0.818～0.928），可有效辅助临床预测DKD 患者肾功能进展情况。然而值得注意的是，病程作为评估DKD 患者病情的一个重要指标，但本研究显示血清let-7d mRNA相对表达量与病程无明显的相关性，这可能由以下几点原因导致：①通常DKD 患者在入院治疗后，病情会延缓、控制，病程通常需要在一个较大的跨度才能明显体现肾功能损伤的差距，而本研究选取患者病程均相差不大，因此病程对疾病的影响较小；②本研究选取的病例数较少，且为单中心研究，可能会导致部分结果出现一定的偏差。

综上所述，let-7d 在DKD 患者血清中的表达水平降低，且其表达水平与DKD 患者肾功能进展情况密切相关，调控肾纤维化进展可能是其参与疾病的发生、发展的重要作用机制。另一方面，目前对于let-7d 的研究更多还是集中在恶性肿瘤方面，其在纤维化中起到的作用值得进行更多、更加深入的研究。