临床耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌对头孢他啶/阿维巴坦的药物敏感性分析

徐卫皓，杨凤真，伊茂礼，薛兆平，王 鑫，张玉梅（.滨州医学院基础医学院病原生物学教研室，山东烟台 64000；.烟台毓璜顶医院检验中心，山东烟台 64000）

随着各类抗生素的广泛应用，细菌耐药率呈现快速增长趋势，其中耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)由于高度耐药、致死率高、传播速度快而备受关注，被世界卫生组织列为全球耐药的紧急威胁[1-2]。CRE 种类繁多并且在不断增加，且易携带和产生新的对其他抗生素的耐药基因，为临床诊治提出巨大挑战，迫切需要新的药物来解决耐药菌这一难题。头孢他啶/ 阿维巴坦（cerftazidime-avibactam，CZA）于2015年通过美国FDA 批准上市，主要用于治疗成人复杂性泌尿系统感染和复杂性腹腔感染，医院获得性细菌性肺炎（包括呼吸机相关的细菌性肺炎），以及治疗方案有限的由需氧革兰阴性菌引起的其他感染的治疗[3-4]。CZA 为这些严重且难以治疗的感染提供了一个有价值的新选择。国家药品监督管理局2019年批准CZA 在我国上市，目前在国内的使用和研究尚少，尽管它对革兰阴性杆菌的有效性已被证明，但一些国家已经报告了对CZA 的耐药性，这需要引起广泛的关注，本研究通过分析携带不同碳青霉烯酶的CRE 菌株对CZA 的敏感性，为临床CRE感染患者的治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集烟台毓璜顶医院2018年1月～2020年12月临床分离并保存的CRE 菌株（亚胺培南和/或美罗培南MIC ≥4μg/L），剔除同一患者同一部位分离的重复菌株，共计98 株。质控阴性菌株大肠埃希菌ATCC25922 购自卫生部临床检验中心，质控阳性菌株为经DNA 测序明确产blaKPC，blaIMP，blaVIM，blaNDM和blaOXA-48碳青霉烯酶基因的菌株（阳性菌株由青岛大学附属医院检验科惠赠）。

1.2 仪器与试剂 法国生物梅里埃公司生产的VITEK-2 Compact 全自动微生物鉴定药敏仪，BRUKER 飞行时间质谱仪，海精宏实验室设备有限公司生产的GNP29270 型恒温培养箱，君意电泳公司生产的JY04S-3E 全自动凝胶图像分析系统和来自美国ABI 公司的VerTti 梯度PCR 仪，北京市六一仪器厂生产的DYY-6C 型电泳仪，北京百晶公司生产的BG-subMIDI（v）可见光电泳-透射仪。英国OXOID 公司生产的血琼脂平皿，法国生物梅里埃公司的VITEK-MSCHCA 基质液，亚胺培南和美罗培南药敏纸片为赛默飞公司生产，CZA 药敏纸片和BMD药敏板由辉瑞公司赠予。Premix Taq™酶，DNA Marker 和细菌基因组DNA 提取试剂盒均购于艾科瑞生物公司，5 种碳青霉烯耐药基因的引物由擎科生物公司青岛合成部合成。

1.3 方法

1.3.1 培养和鉴定：复苏保存的CRE 菌株，在VITEK-2 Compact 全自动微生物鉴定药敏仪上进行菌株鉴定和药敏试验，所有菌株均通过药敏纸片扩散法进行验证，确定为CRE。并使用BRUKER 飞行时间质谱仪进行鉴定复核，要求BRUKER 的评分大于2.0。最后再将鉴定到菌种水平的CRE 菌株接种在血琼脂平皿上，置35℃二氧化碳恒温培养箱孵育16～20h。

1.3.2 头孢他啶/阿维巴坦药敏试验：药敏试验标准和结果判读根据2020 版CLSI M100 执行。药敏纸片扩散法检测98 株CRE 菌株对CZA 的药物敏感性，对CZA 抑菌圈直径在20～22mm 区域的菌株用微量肉汤稀释法验证，头孢他啶/阿维巴坦药物浓度测定范围0.03/4mg/L～64/4mg/L。药敏试验标准和结果判读根据2020 版CLSIM100 执行[5]。

1.3.3 PCR 法检测碳青霉烯酶基因型：采用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA 作为PCR 模板，扩增5 种常见的碳青霉烯酶基因，包括A 类丝氨酸酶（blaKPC）、B 类金属酶（blaNDM，blaVIM，blaIMP）、D 类丝氨酸酶（blaOXA-48）。目的基因、引物序列、产物长度及退火温度等见表1。基因blaNDM和blaKPC的PCR 反应条件：94 ℃5min，（94 ℃30s，60 ℃40s，72℃60s）30 cycle，60℃10min；基因blaVIM，blaIMP和blaOXA-48的PCR 反应条件：94℃5min，（94℃30s，55℃40s，72℃1min）30cycle，55℃10min。产物经15g/L 琼脂凝胶电泳后，用凝胶成像系统分析。部分耐药基因阳性菌株凝胶电泳图见图1。将有阳性条带菌株的扩增产物送基因测序，并应用BLAST 比对并确认基因型。

表1 PCR 扩增引物的名称及产物

图1 部分耐药基因阳性菌株凝胶电泳图

1.4 统计学分析 应用SPSS 20.0 软件对数据进行统计学分析，计数资料用n(%)表示。

2 结果

2.1 头孢他啶/阿维巴坦药物敏感性结果 见表2。实验CRE 菌株对头孢他啶/阿维巴坦敏感23 株（23.47%），其中携带blaKPC基因型14 株，携带blaOXA-48基因型3 株，同时携带blaKPC和blaNDM基因1 株，未检出基因型5 株。

表2 携带不同耐药基因型的CRE 对CZA 的药物敏感性

2.2 PCR 法检测碳青霉烯酶基因型结果 共检测98 株CRE 菌株，检出92 株携带碳青霉烯酶耐药基因，其中70 株含blaNDM（71.43%），14 株含blaKPC（14.29%），4 株同时含blaKPC和blaNDM（4.08%），3 株含blaOXA-48（3.06%），1 株含blaIMP（1.02%），未检出基因型6 株（6.12%）。我院临床分离的CRE 菌株以产B 类金属β-内酰胺酶为主（72.45%，71/98），其次为产丝氨酸碳青霉烯酶型（17.35%，17/98），双酶型（4.08%，4/98），未检出碳青霉烯型（6.12%，6/98）。

3 讨论

产生碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药最主要的机制[6]。研究显示，不同国家、不同省份、不同医院、不同人群以及不同菌属所携带的碳青霉烯酶种类均有差异[7]。在我国，产生KPC 或NDM 型碳青霉烯酶是CRE 最主要的耐药机制，从地域分布来看，与南方相比，我国北方综合性医院临床分离的CRE 菌株产NDM 型较KPC型多[8]。新药头孢他啶/阿维巴坦可有效抑制丝氨酸碳青霉烯酶，而对产金属酶的菌株无活性[3]。我院临床分离的CRE 菌株以产B 类金属β-内酰胺酶为主，因此CZA 对我院CRE 菌株整体敏感性不高。研究显示，头孢他啶/阿维巴坦在使用过程中，可能会出现诱导耐药，为避免抗生素滥用而出现新的耐药菌，使用前准确、快速地对CRE 产生的碳青霉烯酶进行检测并分型，筛选出对CZA 敏感/耐药的表型，对于临床重症CRE 抗感染治疗的精准用药和医院感染预防控制具有重要的价值。

体外药敏试验显示，对于单产丝氨酸碳青霉烯酶的CRE 菌株敏感性高达100%，对单产B 类金属β-内酰胺酶的CRE 耐药率为100%。基于之前研究积累和本实验研究总结，对于单产金属酶的CRE菌株，可认为CZA 对其耐药；对于单产丝氨酸碳青霉烯酶的CRE菌株，需用药敏方法对其进行验证，对于不具备CZA 药敏的实验室可报告CZA 可能对其有活性。这为临床CRE 菌株在使用头孢他啶/阿维巴坦的治疗上指明了基本方向。

之前研究认为头孢他啶/阿维巴坦对于携带金属酶的CRE 菌株无体外活性，这是由阿维巴坦的抑菌谱决定的。而本研究中有一株肺炎克雷伯菌的药敏结果值得讨论，经金标准PCR 法多次验证该菌同时携带blaKPC和blaNDM耐药基因，而对CZA 敏感。此结果，与张敬霞等[9]学者发现的1 株双基因型的CRE 对CZA 敏感相似。分析可能有两方面原因：①体外药物敏感性与携带耐药基因的量有关，此菌携带NDM 酶（B 类金属β-内酰胺酶）含量较少，PCR 电泳也发现此菌NDM 条带较浅。②本菌虽同时携带blaKPC和blaNDM耐药基因，但不表达blaNDM耐药基因。故证实对于同时产金属酶和丝氨酸酶的CRE 菌株，并非全耐药，需要进行头孢他啶/阿维巴坦药敏试验进行验证。

头孢他啶/阿维巴坦对不产酶的CRE 菌株具有良好的活性，但并非全敏感。本研究中有6 株CRE菌株未检出基因型，可能是由产碳青霉烯酶以外的耐药机制介导的，其中5 株不产酶的CRE 菌株对CZA 敏感，敏感率83.3%，1 株不产酶的大肠埃希菌对CZA 耐药。此耐药菌头孢他啶/阿维巴坦K-B法检测抑菌圈直径为21mm，纸片法判为敏感，经验证MIC 值为＞64/4mg/L，证实此菌对CZA 耐药。本耐药菌株证实：①头孢他啶/阿维巴坦药敏纸片扩散法存在假敏感。此判断与另一学者对于肠杆菌目细菌纸片扩散法会出现假敏感的结论一致[10]。②K-B 法检测CZA，敏感和耐药的判定标准仅差1mm，可能存在系统误差。③此菌耐药机制可能由Ampc 酶突变引起，此猜测有待进一步验证。基于之前学者和本研究总结，对于大多数不产酶的CRE菌株，CZA 对其有良好的活性，但仍需要增加确证性药敏试验对其进行验证。

对于肠杆菌目细菌，药敏纸片扩散法结果会出现假敏感。这时就需要对CRE 菌株进行产酶类型的检测，结合产酶类型指导临床精准用药。研究中有一株阴沟肠杆菌，PCR 显示携带blaNDM耐药基因,但K-B 法检测抑菌圈为24mm，用肉汤稀释法进行验证，MIC 值为＞64/4mg/L,对头孢他啶/阿维巴坦耐药。此菌K-B 法检测抑菌圈并不在指南要求验证的检测范围20～22mm，却出现了假敏感，进一步提示临床需要增加碳青霉烯酶型或基因型检测方法作为临床判断用药的参考依据，保证药敏结果的准确性。有学者做了CZA 微量肉汤稀 释法和纸片法相关性方面的研究，K-B 法抑菌圈≥23mm 的，假敏感率为4.36%[11]。虽然这部分菌株所占比例很少，但在临床药敏报告中应特别注意，应结合产酶类型将药敏结果修改为耐药。

综上所述，携带不同碳青霉烯酶的CRE 菌株对头孢他啶/阿维巴坦的药物敏感性不同。对不具备头孢他啶/阿维巴坦药敏的实验室，可根据CRE 菌株是否产生碳青霉烯酶及产酶类型指导临床用药。对于能够开展头孢他啶/阿维巴坦药敏的实验室，也应结合产酶类型综合判断，以免药敏结果出现假敏感或假耐药。头孢他啶/阿维巴坦在国内仍处于初上市阶段，临床应用较少，关于其耐药的研究报道较少，因此需要进一步积累菌株进行科研分析。建议临床微生物实验室有针对性的开展头孢他啶/阿维巴坦的体外药物敏感试验，同时增加酶型检测方法检测碳青霉烯酶型并结合病人相关病情综合考虑，为临床抗感染治疗的精准用药和医院感染预防控制提供有利依据。