二氧化硫体内衍生物通过ROS/JNK/AP-1通路诱导大鼠切牙成釉器细胞AE2蛋白表达上调

任洪玥，杨进，刘霞，姚杰，林昌虎，涂成龙,3,*

1. 贵州医科大学公共卫生与健康学院，贵阳 550025 2. 贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵阳 550025 3. 贵州医科大学毒性检测中心，贵阳 550025

干扰上述牙源性细胞生理功能及成釉过程的各种因素，都有可能影响牙齿的正常发育，产生不良后果。目前认为，牙胚发育过程中持续过量地氟摄入是导致釉质发育障碍引起氟斑牙发生的根本原因，但具体发病机制尚不完全清楚[4]。自由基学说提出，高生物活性的氟化物对成釉细胞抗氧化防御系统的破坏是导致“氟斑牙”呈现釉基质蛋白滞留与釉质矿化不全的关键机制之一[5-8]。而值得注意的是，在我国西南部“燃煤型氟斑牙”病区环境中常合并高硫煤系分布，敞炉燃煤致居室内空气污染易出现超国家限量浓度的SO2与含氟烟气并存的情况。早前有相关研究就该现象进行了动物实验研究，发现相较于二者单独染毒，同时接触大剂量氟化物与SO2烟气时大鼠氟斑牙患病程度更严重，提示SO2对氟致氟斑牙的过程可能起到加强作用[9]；再有，SO2与氟化物共同暴露时将对雄性大鼠肾及睾丸组织产生更严重的损伤[10-11]，更加说明SO2的存在将使氟化物产生更复杂的毒性效应。但以上研究均未就SO2在“氟硫联合”过程中发挥毒作用所涉及的可能机制进行讨论。而除了对呼吸系统造成损害外，SO2还可影响多脏器的生理功能，是一种具有多种毒作用的全身性毒物。SO2经呼吸道吸收入血后在血液微碱性的环境中即转变为其衍生物——亚硫酸盐和亚硫酸氢盐(物质的量比约为3∶1)，以其衍生物的形式随血液循环至全身，对体内组织细胞产生毒作用[12]。降低体内抗氧化物质水平、削弱体内抗氧化防御系统是SO2发挥毒作用的关键环节[13]。因此，本研究以氧化应激为切入点，探讨SO2体内衍生物对大鼠切牙组织抗氧化防御系统及成釉器细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信号转导通路关键蛋白与AE2蛋白表达的影响，探究其对牙齿发育相关生理过程的潜在毒性及可能机制，为后续深入“氟硫联合”过程中SO2毒作用的毒理学研究提供实验资料。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验动物分组及处理

本研究采用SPF级雄性4周龄Wistar大鼠，体质量100～120 g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK(湘)2019-0013。适应性饲养1周后按体质量随机分5组，即高、中、低二氧化硫衍生物混合液染毒组、生理盐水对照组、高剂量二氧化硫衍生物混合液+抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)拮抗组，染毒剂量分别为100 mg·kg-1·d-1(1/10LD50)、50 mg·kg-1·d-1(1/20LD50)和25 mg·kg-1·d-1(1/40LD50)，对照组予0.9%氯化钠注射液，高剂量+NAC组每次腹腔注射前30 min予200 mg·kg-1NAC水溶液灌胃，后与高剂量染毒组进行相同操作，各染毒组均于每日上午9:00行腹腔注射一次，给药容积为2 mL·kg-1，连续4周。饲养期间动物自由饮水、摄食，环境温度为(22±2) ℃，光照明暗各12 h，相对湿度为(50±10)%。末次给药后禁食24 h，取相应生物样本进行实验。

1.2 主要试剂

亚硫酸钠(Na2SO3)、亚硫酸氢钠(NaHSO3)分析纯，购自美国Sigma公司，N-乙酰半胱氨酸购自美国Sigma公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)检测试剂盒购自南京建成生物有限公司，大鼠活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)Elisa测定试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，AE2兔抗大鼠多克隆抗体购自美国Invitrogen公司，p38 MAPK兔抗大鼠单克隆抗体、p-p38 MAPK兔抗大鼠单克隆抗体、SAPK/JNK兔抗大鼠多克隆抗体、p-SAPK/JNK兔抗大鼠单克隆抗体、ERK1/2兔抗大鼠多克隆抗体、p-ERK1/2兔抗大鼠多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，Histone H3兔抗大鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京爱必信生物技术有限公司。

二氧化硫体内衍生物混合液的制备。取适量亚硫酸钠与亚硫酸氢钠，以3∶1的物质的量比溶于0.9%生理盐水，每日新鲜配制。

1.3 大鼠切牙组织氧化应激相关指标测定

完整分离大鼠双侧下颌骨及切牙组织，取其中一侧用纱布仔细去除包绕的肌肉及结缔组织后置液氮中研磨成骨粉，并于组织破碎仪中进一步粉碎。取适量骨粉按1∶9的质量体积比加入预冷的0.9%生理盐水制成10%组织匀浆，蛋白含量的测定采用BCA法。按不同测定指标的样品前处理要求离心后取上清液，依试剂盒说明书检测切牙组织中MDA、GSH水平及SOD、GSH-Px活性。

1.4 切牙组织ROS水平测定

骨粉的制备同1.3，取适量骨粉按1∶9的质量体积比加入预冷的PBS(0.01 mol·L-1, pH=7.4)，冰上充分研磨混匀制成切牙组织匀浆液，5 000×g，离心10 min，取上清液按照试剂盒说明书测定切牙组织ROS水平。

1.5 Western blot法测定大鼠成釉器细胞MAPKs/AP-1信号通路相关蛋白及AE2蛋白表达水平

取前述待用的另一侧大鼠切牙组织，参考Houari等[14]的处理方法，仔细拨开包绕切牙根部的下颌骨，分离出成釉细胞组织，用含PMSF的RIPA裂解液4 ℃匀浆，冰上裂解15 min提取总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量，分子量为30～160 kD与12～60 kD的蛋白分别选用8%或12% SDS-PAGE分离胶进行电泳分离，转膜后5%脱脂牛奶室温封闭1 h，磷酸化蛋白用5% BSA封闭液封闭1 h，分别加入适量AE2抗体(1∶1 000)、p38 MAPK抗体(1∶1 000)、p-p38 MAPK抗体(1∶1 000)、SAPK/JNK抗体(1∶1 000)、p-SAPK/JNK抗体(1∶1 000)、ERK1/2抗体(1∶1 000)、p-ERK1/2抗体(1∶1 000)及β-actin抗体(1∶2 000) 4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜10 min共3次，1∶4 000倍稀释二抗室温孵育2 h，TBST洗膜10 min共3次，ECL显色液显影，凝胶成像系统扫描并检测蛋白条带密度。

1.6 统计学分析

2 结果(Results)

2.1 二氧化硫体内衍生物混合液对大鼠切牙组织抗氧化防御系统的影响

与对照组比较，中、高剂量组大鼠切牙组织SOD、GSH-Px活性和GSH水平下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；MDA、ROS水平升高(P<0.05)。与高剂量组比较，高剂量+NAC组SOD和GSH-Px活性升高，GSH水平上升，MDA、ROS含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)，如表1所示。

表1 二氧化硫体内衍生物对大鼠切牙组织抗氧化防御系统相关指标的影响Table 1 Effects of sulfur dioxide derivatives on indexes of antioxidant defense system of rat incisor tissue n=6)

2.2 二氧化硫体内衍生物对大鼠成釉器细胞MAPKs/AP-1信号通路相关蛋白表达的影响

如图1所示，低、中、高剂量组及高剂量+NAC组大鼠成釉器细胞p-p38 MAPK/p38 MAPK及p-ERK/ERK改变较对照组均无显著差异。而低剂量组大鼠成釉器细胞JNK磷酸化水平改变较对照组无显著差异，中、高剂量组磷酸化JNK/JNK水平较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且经趋势性检验，JNK磷酸化水平升高趋势表现出二氧化硫衍生物染毒剂量依赖性(F=158.58，P<0.05)。与高剂量组比较，高剂量+NAC组磷酸化JNK/JNK水平显著降低(P<0.05)，差异有统计学意义。

图1 二氧化硫体内衍生物对大鼠切牙成釉器细胞MAPKs信号通路关键蛋白表达的影响注：(a)MAPKs信号通路关键蛋白蛋白免疫印迹条带；(b)成釉器细胞MAPKs信号通路关键蛋白相对表达水平；A对照组，B高剂量组，C中剂量组，D低剂量组，E高剂量+NAC组；与对照组比较，# P<0.05；与高剂量组比较，*P<0.05；n=3。Fig. 1 Effects of sulfur dioxide derivatives on expression of key proteins in MAPKs signaling pathway of rat incisor enamel organ cellsNote: (a) Immunoblotting bands of key proteins in MAPKs signaling pathway; (b) Relative expression of key proteins in MAPKs signaling pathway; A means control group, B means high-dose group, C means medium-dose group, D means low-dose group, and E means high dose+NAC group; # P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs high-dose group; n=3.

如图2所示，与对照组比较，中、高剂量组大鼠成釉器细胞胞浆中c-Fos、c-Jun蛋白水平较对照组明显下降(P<0.05)，核内c-Fos、c-Jun蛋白水平明显上升(P<0.05)，提示高剂量组AP-1蛋白发生核转位。而高剂量+NAC组AP-1蛋白核转位较高剂量组显著减少(P<0.05)，差异有统计学意义。低剂量组较对照组核内c-Fos蛋白水平升高，但总体AP-1蛋白核浆分布改变无明显差异。

图2 二氧化硫体内衍生物对大鼠切牙成釉器细胞胞质及胞核中c-Fos与c-Jun蛋白表达的影响注：(a)胞质中c-Fos与c-Jun蛋白相对表达水平；(b)胞核中c-Fos与c-Jun蛋白相对表达水平；A对照组，B高剂量组，C中剂量组，D低剂量组，E高剂量+NAC组；与对照组比较，# P<0.05；与高剂量组比较，*P<0.05；n=3。Fig. 2 Effects of sulfur dioxide derivatives on expression of c-Fos and c-Jun protein in cytoplasm and nucleus of rat incisor enamel organ cellsNote: (a) Relative expression of c-Fos and c-Jun protein in cytoplasm; (b) Relative expression of c-Fos and c-Jun protein in nucleus; A means control group, B means high-dose group, C means medium-dose group, D means low-dose group, and E means high dose+NAC group; # P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs high-dose group; n=3.

2.3 二氧化硫体内衍生物对大鼠成釉器细胞AE2蛋白表达水平的影响

如图3所示，中、高剂量组AE2蛋白表达较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且经趋势性检验，升高趋势表现出二氧化硫衍生物染毒剂量依赖性(F=530.167，P<0.05)。与高剂量组比较，高剂量+NAC组AE2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，差异有统计学意义。

3 讨论(Discussion)

机体内抗氧化防御系统主要由抗氧化酶类和抗氧化剂构成，它们之间相互协同、相互代偿共同发挥维持机体氧化与抗氧化动态平衡的作用。体内氧化与抗氧化之间的平衡状态被打破可诱导产生各种自由基引起组织氧化损伤，导致细胞功能异常甚至凋亡，从而对多种脏器造成损害[15]。已有多项研究表明，二氧化硫及其衍生物可引起大、小鼠脑、肺、心、肝、脾、肾、胃、肠和睾丸等组织抗氧化物质含量减少，SOD、GSH-Px和过氧化氢酶(catalase, CAT)等抗氧化酶活性改变，脂质过氧化产物含量增加[16-19]。可见，降低体内抗氧化物质水平、削弱体内抗氧化防御系统是二氧化硫及其衍生物发挥毒作用的关键环节之一。基于此，本研究通过亚急性腹腔注射二氧化硫体内衍生物构建动物染毒模型，观察二氧化硫衍生物对大鼠切牙组织抗氧化防御系统的影响。结果显示，相较于对照组，中、高剂量染毒组大鼠切牙组织GSH含量、SOD活性和GSH-Px活性下降，同时，脂质过氧化产物MDA、ROS水平显著上升，而预先给予活性氧抑制剂NAC再予高剂量二氧化硫衍生物时，大鼠切牙组织抗氧化防御系统各项指标均较单独施予高剂量二氧化硫衍生物而言有了明显改善，表明二氧化硫体内衍生物可引起切牙组织细胞抗氧化防御系统紊乱，活性氧自由基蓄积，这与其他学者在大鼠心、肝、肺和肾等主要脏器组织中观察到的结果类似。

图3 二氧化硫体内衍生物对大鼠切牙成釉器细胞AE2蛋白表达的影响注：A对照组，B高剂量组，C中剂量组，D低剂量组，E高剂量+NAC组；与对照组比较，# P<0.05；与高剂量组比较，*P<0.05；n=3。Fig. 3 Effect of sulfur dioxide derivatives on the expression of AE2 protein in incisor enamel organ of ratsNote: A means control group, B means high-dose group, C means medium-dose group, D means low-dose group, and E means high dose+NAC group; # P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs high-dose group; n=3.

图4 二氧化硫体内衍生物通过ROS/JNK/AP-1通路诱导成釉细胞AE2蛋白表达潜在机制示意图注：CA表示碳酸酐酶。Fig. 4 Schematic diagram of the potential mechanism of internal sulfur dioxide derivatives inducing AE2 protein expression in ameloblasts through ROS/JNK/AP-1 pathwayNote: CA stands for carbonic anhydrase.

综上，二氧化硫衍生物可激活大鼠切牙组织氧化应激并主要通过ROS/JNK/AP-1信号通路诱导成釉器细胞AE2蛋白表达上调，具有影响切牙细胞生理功能进而干扰牙齿正常形成与发育的潜能。这提示我们，在氟合并硫高背景地区“燃煤型氟斑牙”的产生可能具有更复杂的影响因素，因此，进一步深入探讨二氧化硫的这一“潜能”在“燃煤型氟斑牙”的形成过程中所发挥的作用，氧化应激与AE2在其中扮演了何种角色及此过程涉及的具体机制等问题将有助于从全新角度推进“燃煤型氟斑牙”患病机制的基础性研究。