结直肠癌（CRC）中错配修复蛋白MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 及P53 的表达及其临床意义

朱建雯，杨建梅，邓慧，刘翔，吴凯逸，荀鹏

江苏省扬州市洪泉医院病理科，江苏扬州 225200

结直肠癌（CRC）是消化系统常见恶性肿瘤，发病率因胃肠镜的使用逐年递增， 发病年龄亦趋于年轻化[1]。 相关报道指出，CRC 的发病率高居恶性肿瘤第三，病死率高居第二[2-3]。因为当下饮食结构摄取精细食物较多，营养过剩，加之运动量减少，CRC 发病风险升高； 整个病情的进展涉及不同种类基因蛋白组突变、多种途径或通路。 CRC 的发病主要分为染色体不稳定和微卫星不稳定两种途径。 微卫星不稳定主要是因DNA 错配修复缺陷导致。与微卫星不稳定相关的CRC 发病率约为15%[4]。 错配修复蛋白不表达、过度表达或表达缺失会引起基因突变，或DNA复制过程中甲基化失活，错配修复系统功能异常，缺陷发生后造成微卫星不稳定的发生。 错配修复蛋白的正常表达可修复DNA 复制过程中错配的碱基对，从而防止基因突变的发生， 以达到抑制肿瘤发生目的。国内外研究均指出多种类型、不同发病部位的肿瘤的发病均与错配修复蛋白的表达异常相关[5-6]。 随着分子检测技术的精进， 实验室对恶性肿瘤的病理诊断准确性不断提高。该研究随机抽出该院2019 年12 月—2021 年5 月61 例结直肠癌（CRC）病例作研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机抽出61 例结直肠癌（CRC）病例作研究，61例CRC 患者均接受手术根治性切除且完成组织病理活检。 其中男29 例，女32 例；年龄41~93 岁，60 岁 及 以 下 者38 例，60 岁 以 上 者23 例， 平 均（61.74±12.57）岁；肿瘤最大径2~7 cm，平均（4.69±1.25）cm；左半结肠23 例、右半结肠30 例、直肠8例；TNM 分期：Ⅰ期10 例、Ⅱ期15 例、Ⅲ期20 例、Ⅳ期16 例。 患者均为自愿参与该研究，签署相关知情同意书； 研究经该院医学伦理协会审核修订后批准实施。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准： ①全部调研对象均经病理组织活检诊断为CRC；②均为初诊患者，未接受手术疗法之外的其他治疗； ③可按标准完成整个研究。 排除标准：①继发性CRC；②非初诊患者；③非手术治疗者；④结直肠良性肿瘤等患者。

1.3 方法

免疫组化检测：手术中切下病灶标本，将组织标本放入中性液体中进行固定，常规脱除标本水分，进行石蜡包埋。 标本切片至4 μm，下一步按照EnVision 说明书分两步进行HE 染色和免疫组化染色，最后一步完成检测。 抗体试剂分别为MLH1 和MSH6 鼠抗人单克隆抗体，MSH2 和PMS2 兔抗人单克隆抗体，均购于中国生物技术股份有限公司。

1.4 观察指标

观察肿瘤细胞核着色情况：无论着色深浅、着色范围，明确着色即为（+）。 无着色评定为（-），4 种蛋白其中任一发生缺失则为不稳定； 而4 种蛋白均未缺失，正常表达即为稳定。P53 蛋白着色为（+），结果为（+）患者均观察10 个×400 视野，计算阳性比，阳性比在30%及以上则为表达（+），反之则为（-）。 所有结果的判定均由3 位工作年资10 年以上的病理科医师盲法独立完成。

1.5 统计方法

采用SPSS 25.0 统计学软件处理数据， 计数资料用[n（%）]表示，进行χ2检验；完成Spearman 相关性分析。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 错配修复蛋白及P53 蛋白表达结果

4 种蛋白均在肿瘤细胞细胞核内表达，61 例CRC 患者表达缺失占比约18.03%（11 例）；MLH1 表达缺失7 例（11.48%）、MSH2 表达缺失4 例（6.56%）、PMS2 表达缺失7 例（11.48%）、MSH6 表达缺失3 例（4.92%）；MLH1、PMS2 共同表达缺失5 例（8.20%），MSH2、MSH6 共同表达缺失2 例（3.28%）。 P53 蛋白表达阳性率29 例（47.54%）。

2.2 错配修复蛋白表达与CRC 关系

错配修复蛋白的表达与组织分型、TNM 分期有关（P＜0.05）。与其他临床病理因素无关（P＞0.05）。见表1。

2.3 P53 蛋白表达与CRC 关系

P53 蛋白阳性表达与组织分型、TNM 分期、淋巴结转移有关（P＜0.05）。与其他临床病理因素无关（P＞0.05）。 见表2。

表2 P53 蛋白表达与CRC 关系[n（%）]

2.4 微卫星不稳定与P53 蛋白表达相关性分析

将研究设计相关数据录入系统，经Spearman 相关性分析得，P53 蛋白表达阳性与微卫星不稳定呈现负性相关（r=-0.136，P＜0.05）。

3 讨论

CRC 的发病最典型的临床症状就是无症状，肠道恶性肿瘤的发病症状多与息肉、痔疮等疾病类似，极易被忽略；CRC 患者病情进展至晚期均无典型临床症状，确诊患者多预后不良，且病死率高。目前，胃肠镜作为体检项目的开展， 能让部分患者在发病早期确诊，可接受手术、放化疗等治疗，但病情进展快，预后不理想，对治疗不利。 以往的研究指出，CRC 发病主要是因上皮细胞发生瘤变，再癌变[7]。 但深入的基因研究发现，DNA 错配修复缺陷以及引起的微卫星不稳定通路是重要通路[8]。 正常机体内，DNA 错配修复是维持基因稳定、正常遗传信息的重要保障，错配修复蛋白能在DNA 复制时识别错配的碱基对，并加以修复，确保基因可稳定遗传。若在这个过程中因错配基因突变型失活或修复基因甲基化失活， 造成微卫星不稳定，就会引起相关蛋白异常表达；若该过程中某些抑癌基因和癌基因表达异常， 即会引起肿瘤的发生[9-10]。

错配修复蛋白的表达缺失是CRC 患者微卫星不稳定状态最直观的反馈，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 为4 种主要蛋白， 错配修复系统异常会直接导致一种或多种蛋白异常表达， 因此通过检测错配修复蛋白的表达缺失情况， 即可监测CRC 疾病状态。 通过免疫组化检测错配修复蛋白的表达缺失情况可以预测CRC 微卫星不稳定状态。错配修复过程中MLH1、MSH2 两种蛋白通过结合同源蛋白生成二聚体调控错配修复作用， 而PMS2 是MLH1 的配对蛋白，MSH6 是MSH2 的配对蛋白， 主导蛋白MLH1和MSH6 突变后会引起对应二聚体降解， 引起主蛋白与配对蛋白共同缺失的发生。 因此，PMS2 蛋白会随着MLH1 蛋白的缺失而缺失，MSH6 蛋白亦会随着MSH2 蛋白的缺失而缺失， 多表现为2 种蛋白共同缺失。 该研究结果显示：61 例CRC 患者错配修复蛋白表达缺失约占18.03%，单种蛋白表达缺失占比最低为4.92%，最高11.48%，MLH1、PMS2 共同表达缺失为8.20%明显高于MSH2、MSH6 共同表达缺失3.28%，MSH2、MSH6 表现为共同缺失， 且两种蛋白共同缺失也符合上述内容。 该研究结果显示，P53 蛋白表达阳性率47.54%，其中4 种错配修复蛋白表达缺失与组织分型、TNM 分期相关，P53 蛋白阳性表达与组织分型、TNM 分期、 淋巴结转移有关；P53 蛋白表达阳性与微卫星不稳定呈现负性相关。 有研究指出，结直肠癌患者P53 蛋白表达阳性率为44.9%，其表达与MSI 表现为负性相关 （r=-0.169，P＜0.05）[11]，该研究结果与其具有一致性， 提示微卫星不稳定与P53 蛋白突变可能CRC 发病的两种不同机制，分别在疾病不同阶段发挥作用。 P53 蛋白构成重要的抑癌基因，参与DNA 损伤修复、细胞凋亡、细胞生命周期阻滞等过程[12]。 肿瘤病情的进展与P53 蛋白突变关系密切， 约50%的恶性肿瘤患者均存在P53 突变[13-14]。 有研究指出，CRC 患者P53 蛋白突变耐药性更高，说明P53 蛋白突变与预后不良关系密切[15-16]。但P53 蛋白有不同类型，野生型和突变型蛋白缺失诱发的癌变机制也不同，野生型P53 蛋白缺失与侵袭程度相关，突变型P53 蛋白则具有功能获得活性[17-18]。不同类型CRC 在发病机制和通路上存在差异，因此P53 蛋白的研究有利于明确CRC 发病机制，对临床诊断、靶向治疗、预后监测等有里程碑意义。

微卫星稳定性的检测可预测CRC 的预后，可作为预后标志物应用于临床，早期CRC 患者术后辅助治疗方案可借鉴检测结果。4 中错配修复蛋白与P53蛋白的表达均与TNM 分期相关，因此微卫星稳定性的检测对TNM 分期患者预后有一定的预测价值，但该研究尚无法阐明微卫星状态预测预后的相关机制，可能与肿瘤细胞毒性淋巴细胞的活性反应强烈，突变后引起一系列免疫反应相关。

综上所述，CRC 的临床诊断和治疗中， 建议进行微卫星稳定性相关的错配修复蛋白表达检测，以指导患者的诊疗方案的制订， 同时还可应用于预后的监测。