基于《中华医典》探讨金银花用药规律及核心组合药物的现代药理活性挖掘＊

刘 双 ，耿 炜 ，张红艳 ，王 凯 ，王 晓 ，董红敬 ＊＊

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省分析测试中心 济南 250014；2.齐鲁工业大学（山东省科学院）药学院 济南 250300；3.山东省妇幼保健院 济南 250014；4.山东中医药大学第二附属医院 济南 250014）

金银花（Lonicera Japonica Thunb.）又名忍冬花，是忍冬科忍冬属植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花[1]。金银花具有悠久的药用历史，“金银花”一名出自《本草纲目》，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，故得名金银花[2]，金银花具有清热解毒、疏风散热的功效，是一味临床常用中药。传统中药复方是我国的文化瑰宝，复方是多种中药以配伍形式组成，中药的配伍原则是古人的智慧结晶，而药对是中药配伍的基本形式，药对是连接中药与方剂的枢纽[3]。药对虽组成简单，但具有协同增效或配伍减毒等作用，且体现了历代医学家临床用药的经验总结[4]。

网络药理学是近年来的新兴学科，是阐明药物-成分-靶点-疾病之间的内在联系、揭示药物的作用途径的一门前沿学科[5]。网络药理学基于系统生物学和多向药理学研究理论、高通量筛选和网络分析及可视化技术等，系统地、整体地分析中药复方[6-8]，有利于从分子机制层面阐明成分在预防或治疗疾病方面发挥作用的途径，揭示中药多成分-多靶点-多途径的效用特点[9]，综合地反应药物对疾病网络的干预机制，这与中药整体性、系统性治疗疾病的特点不谋而合，已成为分析中药作用机制的有力工具[10-11]。如采用网络药理学探究黑逍遥散治疗阿尔茨海默病的作用机制[12]，运用网络药理学挖掘巴西人参的核心功效[13]。因此，采用数据挖掘技术挖掘金银花的核心药对并借助网络药理学预测核心药对的现代药理活性，可为金银花药对的发现及深入研究提供理论基础。

图1 研究思路流程图

本文以《中华医典》中含金银花的处方为基础，借助数据挖掘技术和网络药理学技术分析含金银花组方的用药规律并分析核心药物组合的现代药理活性，通过细胞实验验证其现代药理活性（见图1），以期为传统复方的研究与开发以及“老药新用”提供新思路。

1 材料与方法

1.1 数据来源、数据筛选及处理

通过《中华医典》数据库（http://www.tcmbook.cn），以“金银花”为关键词，检索含有“金银花”的中药复方，检索时间为建库至2021年10月25日。

给药方式为口服的中药复方被纳入分析范围。根据《中国药典》2020版以及《中华本草》来规范各处方的中药名称。如：生地规范为地黄、熟地规范为熟地黄、生芪规范为黄芪等。

1.2 用药规律分析

将筛选并规范好的中药复方录入Excel表格中，由双人负责数据审核，以确保数据的准确性。借助数据透视表对中药的使用频次进行统计。将数据整理成Y和N的格式，即复方中含有这味药标记为Y，不含有这味药物标记为N，最后添加一组全为N的复方。借助SPSS Modeler 18.0软件进行复杂网络分析，通过源节点导入Excel格式数据，选择字段面板中的类型节点，将数据类型设置为标记，角色设置为任意，连接数据节点与数据类型节点。选择图形面板中的网络节点并插入，连接类型节点与网络节点，分析条件设置为仅显示true值标志，可显示的最大链接数为55，“强链接下限”为30，“弱链接上限”为10，按照链接大小显示强/正常/弱类别以显示关联应用网络图，其中，连线的粗细表示两种药物在同一复方中出现的频率。通过SPSS Statistics 26.0软件进行聚类分析，并借助Cytoscape软件[14]实现网络可视化。

1.3 现代药理活性挖掘

1.3.1 药物作用靶点的获取及其与疾病的相互作用关系

综合分析频次统计、复杂网络、关联规则分析结果，筛选出核心药物组合。通过TCMSP数据库[15]（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和TCMIP数据库[16]（http://www.tcmip.cn/）获取核心药物的化学成分及作用靶点，并进行去重和规范，采用String数据库[17]（https://cn.string-db.org/）查询靶点蛋白对应的基因名称。

CTD数据库（http://ctdbase.org/）是一个强大的、公开的研究资源，是用于描述化学物质、基因和人类疾病之间关系的科学依据，CTD数据库收录了许多描述跨物种化学基因/蛋白质相互作用和化学-疾病关系以及基因-疾病关系的精确数据[18]。借助CTD数据库，分析所有靶点相关的潜在疾病；通过Excel中的数据透视表统计靶点的出现频次，得到出现频次较高的靶点作为关键靶点，利用Excel使关键靶点与疾病相互映射，利用Cytoscape软件构建“中药-关键靶点-疾病”网络并分析拓扑网络，分析药-靶-病之间的内在关系。

1.3.2 生物功能富集分析

采用String数据库分析关键靶点的蛋白互作网络（PPI），进一步筛选核心靶点，基于DAVID数据库[19]（https://david.ncifcrf.gov/）对关键靶点进行GO富集分析及KEGG通路富集分析。

2 核心药物组合的体外验证

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤中发病率位居第三，死亡率位居第二。HCT116细胞是1979年从一位患结直肠癌的男性病人中分离得到的，HCT116细胞已成为结直肠癌研究领域中被广泛使用的模式细胞。综合分析数据挖掘的结果，选择HCT116细胞可作为研究对象进行体外验证。

2.1 细胞、试剂与仪器

人结肠癌细胞（HCT116）；金银花、甘草均够自漱玉平民大药房千佛山东路店，金银花提取物、甘草提取物、金银花-甘草提取物为课题组自制（取50 g金银花，精密称定，置1000 mL圆底烧瓶中，精密加入400 mL蒸馏水，放入电热套中进行水浴加热，提取1 h，滤过，浓缩，冻干，得金银花提取物；取50 g甘草，精密称定，置1000 mL圆底烧瓶中，精密加入400 mL蒸馏水，放入电热套中进行水浴加热，提取1 h，滤过，浓缩，冻干，得甘草提取物；取30 g金银花和15 g甘草，精密称定，置1000 mL圆底烧瓶中，精密加入400 mL蒸馏水，放入电热套中进行水浴加热，提取1 h，滤过，浓缩，冻干，得金银花-甘草提取物）；RPMI-1640培养基（Gibco公司，批号：8121354）；PBS缓冲液（Solarbio公司，批号：20210526）；胰蛋白酶（Solarbio公司，批号：20210105）；胎牛血清（杭州四季青公司，批号：20050504）；HF90气套式二氧化碳培养箱（上海力康公司）；Spark多功能微孔板检测仪（瑞士TECAN公司）。

2.2 细胞培养

从-80℃的冰箱中取出冻存的HCT116细胞（购自中国医学科学院基础医学研究所），置于37℃水浴锅中迅速解冻，将解冻后的细胞转移至15 mL离心管，加入适量RPMI-1640培养基混匀后进行离心（1500 r·min-1，5 min），弃上清液。向离心管中加入6 mL 10% FBS 1640培养基，吹打均匀后加到新培养瓶中，摇匀后置于5% CO2、37℃培养箱中培养。待细胞长至80%以上后，弃上清液，加2 mL PBS进行清洗，加1 mL胰蛋白酶在培养箱中消化2 min。加入适量10% FBS 1640培养基吹打细胞使其从瓶底脱离，离心（1500 r·min-1，5 min）后弃上清液，加10% FBS 1640培养基6 mL，吹打均匀后放入新培养瓶中继续培养。

2.3 MTT法检测抑制率

取对数生长期的HCT116细胞，经胰蛋白酶消化并反复吹打后制成单细胞悬液，将细胞浓度调整为5×104·mL-1，以每孔100 μL接种于96孔板中，置于37℃，5% CO2培养箱中培养24 h。分别加入5% FBS 1640培养基配制的金银花组（5 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1）、甘草组（25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1）、金银花-甘草组（25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1）并设置空白组（只含培养基）和阴性对照组（药物浓度为0），每组各接种5孔，继续放入培养箱中分别培养48 h、72 h。向每个孔中加入 50 μL MTT溶液（1.0 mg·mL-1）；继续培养4 h，吸出上清液；加入100 μL DMSO，后用酶标仪在490 nm波长下测定各孔OD值。增殖抑制率按照以下公式计算。

3 结果

3.1 复方数据统计及用药频次分析

共统计金银花组方108首，涉及189味中药。通过分析发现，使用频率在10以上的药物有35味（表1），累计频次825次，占总频次的71.06%，属于高频中药。其中，使用频次前10位的分别是金银花、甘草、当归、连翘、赤芍、防风、黄芩、天花粉、皂角刺、牛蒡子。

3.2 关联规则分析

如图2所示，在复方中共有26味药与金银花配伍使用，其中，金银花、甘草、当归、连翘的相关性较强，在金银花组方中经常一起使用。Apriori算法是用于挖掘数据关联规则的常用算法，该算法可对事务性数据库进行挖掘，得到相互关联的属性，是多个数据挖掘算法的基础算法[20]。在关联规则中，支持度表示前项和后项同时在数据库中出现的比率，置信度表示前项出现的条件下，后项出现的概率。在建模选项板下，选择关联中的Apriori算法，将Apriori节点与类型节点相连接，使用预定义角色，选择最低条件支持度10%，最小规则置信度80%，最大前项数为5，对药物进行关联规则分析。根据Apriori 算法，一共产生202条规则，主要的关联规则见表2、表3、表4。其中金银花-甘草联合使用频率最高，支持度为65.14%。

3.3 现代药理活性挖掘

通过以上研究，发现金银花-甘草联合使用频率最高，因此进一步以金银花-甘草组合为例，通过网络药理学方法对“金银花-甘草”药对的药理活性进行了深层次挖掘。

表1 高频药物使用统计表（频次 ≥ 10）

3.3.1 药物作用靶点的获取及其与疾病的相互作用关系

基于TCMSP、TCMIP数据库，建立金银花、甘草的药物靶点库；采用CTD数据库，获取与药物靶点相关的疾病，共有681个疾病，选取度值最高的前10个疾病及其相关靶点，借助Excel中的数据透视表插件，以获得在较多疾病中出现频次较高的靶点，称为关键靶点，共53个（表5）。

图2 金银花组方的复杂网络

表2 常用2味药物组合关联规则

表3 常用3味药物组合关联规则

表4 常用4味药物组合关联规则

分别将金银花与甘草的作用靶点与疾病相互映射，整理、规范，借助Cytoscape软件建立“中药-关键靶点-疾病”网络（图3），网络共包含65个节点，632条网线。

3.3.2 生物功能富集分析

基于String数据库建立关键靶点的PPI网络，置信度设置为0.4，借助Cytoscape软件进行网络可视化（图4），分析PPI网络，节点的大小和颜色深浅表示Degree值的高低，其中，AKT1、IL6、ALB为Degree值前3的靶点蛋白（Degree ≥ 49，ClosenessCentrality ≥ 0.94，BetweennessCentrality ≥ 0.027）。

表5 关键靶点

图3 中药-关键靶点-疾病网络

通过DAVID数据库进行关键靶点的GO富集分析和KEGG通路富集分析（图5、图6）。GO富集分析包括生物过程（Biological process）、细胞组分（Cellular component）、和分子功能（Molecular function）3个部分。其中，关键靶点富集的生物过程条目包括RNA聚合酶II启动子转录的正调控（Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、凋亡过程的负调控（Negative regulation of apoptotic process）、细胞增殖的正调控（Positive regulation of cell proliferation）等；细胞组分条目包括细胞核（Nucleus）、细胞质（cytoplasm）、胞质溶胶（Cytosol）等；分子功能条目包括蛋白质结合（Protein binding）、转录因子结合（Transcription factor binding）、蛋白激酶结合（Protein kinase binding）等。KEGG通路富集分析结果显示，关键靶点主要富集于HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）等。

图4 PPI网络

图5 GO富集分析

图6 KEGG通路富集分析

图7 药物组抑制率

4 核心药物组合对人结肠癌细胞增殖的影响

与对照组（抑制率为0）比较，金银花组、甘草组和金银花-甘草组，处理细胞48 h后，能对人结肠癌细胞的增殖产生抑制作用，且金银花组较甘草组以及金银花-甘草组的抑制作用更强，随着浓度的升高，抑制作用加强（图7A）；处理细胞72 h后，金银花组和甘草组的抑制率较48 h处理后的金银花组和甘草组有所降低。72 h处理后的金银花-甘草组的抑制率较48 h处理后的金银花-甘草组的抑制率高（图7B），说明不同剂量的金银花-甘草药对处理HCT116细胞72 h，对HCT116细胞增殖有较好的抑制作用。金银花-甘草组对HCT116细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，随着时间与金银花-甘草药对浓度的上升，对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，且浓度越高、时间越长，抑制作用越强。

5 讨论

分析传统复方的用药规律有利于总结和继承名老中医经验。《中华医典》是全面系统整理中医古籍而制成的一本中国历代医学古籍。在《中华医典》收录的含金银花复方中，金银花为君药或臣药以发挥清热解毒功效，如银花解毒汤、清热解毒汤中金银花作为君药，苦参汤、阑尾化瘀汤中金银花作为臣药。当前，金银花药对的挖掘研究较少，而药对是复方的最基本形式；用药频次分析结果显示，甘草在金银花组方中出现的频次较高，故两者有望成为新药对。甘草号称中草药之王，善解百药之毒。近年来，与甘草组成药对的研究较多，比如芍药-甘草药对[21]、麻黄-甘草药对[22]、大黄-甘草药对[23]、苦参-甘草药对[24]、桔梗-甘草药对[25]等。甘草固有调和诸药之功效，但其亦有补气益中、缓急止痛、清热解毒等功效，甘草的功效有且不限于调和诸药。金银花与甘草合用，一方面可以降低金银花的毒副作用；另一方面，金银花和甘草二药的药力温和，对热度较胜者，仅使用金银花或甘草，不能达到理想的效果，两者合用，不仅可以增强金银花清热解毒的功效，还可发挥甘草的甘缓护胃的功效，缓和金银花甘寒对脾胃的影响。

关联规则显示，金银花-甘草、金银花-甘草-当归、金银花-甘草-当归-防风分别是3类组合组中支持度最高的组合。含有金银花和甘草的组方多为清热解毒方，如疏风清热汤、驱风散、消毒散等。临床应用发现，金银花和甘草联用在治疗前列腺炎方面具有较好疗效，甘草中的甘草甜素和甘草次酸具有抗炎抑菌作用，黄酮类成分对平滑肌有解痉挛作用，利于消炎排尿；金银花中的有机酸、黄酮类成分等具有抗菌、抗炎作用，两者联用，对前列腺炎疗效显著，可迅速缓解患者病痛，利于恢复[26]。金银花、甘草、当归联用，金银花清热解毒，疏风散热，当归补血活血，润肠通便，而甘草可以清热解毒，调和药性，三者可以清热解毒，补血活血；在三味药的基础上，再添防风以祛风解表，胜湿止痛。

现代药理活性研究发现，金银花、甘草的药物靶点与肿瘤（Neoplasms）、消化系统疾病（Digestive System Diseases）、心 血 管 疾 病（Cardiovascular Diseases）等有关，展现了中药广泛的药理活性，体现了中药多靶点的作用特点。目前，金银花或甘草单独使用的药效研究较多，比如研究人员从冻干的金银花中提取分离出多酚类成分，发现多酚类成分对人组织淋巴瘤细胞具有抑制作用[27]；甘草中的查尔酮A可以通过增加细胞内ROS水平，降低MMP引起线粒体功能障碍和内质网应激诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡[28]。金银花，性甘、寒，归肺、胃经，既能散风热，又能清胃热而解毒。甘草在治疗常见急、慢性消化道疾病如消化性溃疡、慢性胆囊炎、胆石症等方面具有显著疗效[29]。金银花可以有效地清理血液中的脂肪及有害物质，增加血管血流量，有效预防心肌梗塞等心血管疾病；田行瀚等[30]发现甘草中的甘草查尔酮B、甘草查尔酮C、甘草查尔酮D和刺甘草查尔酮联合使用对心血管疾病的治疗效果显著。

“中药-关键靶点-疾病”网络显示，金银花和甘草组合使用对肿瘤、消化系统疾病、心血管疾病等具有治疗作用，两味药物的作用靶点有所差异，ABCC2、ALB、IGF1R为金银花的特有作用靶点，SIRT1为甘草的特有作用靶点，甘草中的甘草酸可以作用于SIRT1，进而抑制HMGB1的表达，对SAH后神经功能损伤具有改善作用，能明显抑制脑部水肿，神经细胞凋亡[31]。在KEGG通路富集分析结果中，通过调节HIF-1α信号通路，可以改善H/R诱导的心脏微血管内皮细胞功能障碍[32]；通过干预PI3K/AKT信号通路，可减轻心肌凋亡程度，表现出对心肌细胞的保护作用[33]。此外，PI3K/Akt信号通路过度表达和活化与肿瘤的进展密切相关，上游分子通过与PI3K结合，使其构象发生改变，从而磷酸化激活Akt，Akt的活化能调控其下游分子，参与肿瘤调控通路[34]，一旦PI3K/Akt信号通路被抑制，细胞增殖的能力便会下降，细胞凋亡增加[35]。TNF信号通路与受体相互作用蛋白、TNF受体相关因子2、TNF相关死亡结构域蛋白以及Fas相关死亡结构域蛋白等相关，在促进细胞凋亡及炎症反应中发挥重要的作用[36]。

体外实验结果表明，相比于单独使用金银花或甘草，核心药物组合金银花和甘草对结肠癌细胞增殖的抑制作用更强，抑制活性的提高可能是两种中药金银花和甘草中的化学成分生成了新的化学成分，这体现了中药配伍的必要性及科学性，也证实了中药复方绝不是简单的机械相加或组合，而是相辅相成又各司其职；此外，随着浓度的上升，金银花-甘草组的抑制活性逐渐增强，呈剂量依赖性；随着时间的延长，金银花-甘草组的抑制率逐渐提高，表明该药对的治疗效果显著且药效持久。

综上所述，本研究采用数据挖掘技术对《中华医典》中含金银花的组方用药规律进行了分析和探讨，发现金银花组方中甘草、当归、连翘、赤芍、防风等与金银花同时使用的频次较高，明确了含金银花组方的相关药物配伍规律，挖掘出使用频次较高的金银花-甘草药对。运用数据挖掘及网络药理学探讨了金银花-甘草药对的现代药理活性及潜在作用机制，通过人结肠癌HCT116细胞增殖抑制实验对预测出的现代药理作用进行成功验证，证实金银花-甘草药对较单药使用的效果好且疗效持久，体现了中药配伍的科学性、可行性和必要性，也为中药药对的挖掘与应用、传统药对新用途的发现提供了新思路。