着丝粒蛋白U对胃癌细胞增殖、糖酵解的影响及机制

邓桃枝，江雪梅，何周桃，蔡曼妮，陈超超，许泽文

1 海南省肿瘤医院消化内科，海口 570312；2 海南省人民医院消化内科

胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一，有较高发病率及病死率，尽管临床在胃癌的诊断和治疗方面已取得重大进展，但研究显示，与胃癌相关的病死率将继续增加［1］。癌细胞异常代谢是癌症进展的关键因素之一，有氧或缺氧环境下癌细胞均最先以糖酵解途径供能，使癌细胞具有更强的耐受能力［2］。研究表明，当肺正常细胞由于外界环境因素或基因突变等发生癌变后，肺癌细胞新陈代谢速度加快，能量代谢活跃、细胞膜通透性增加、增殖速度加快，都导致癌细胞对能量的需求量增加，最终通过增加糖酵解途径加速提供能量及产生必要的大分子产物［3］。因此，有效抑制癌细胞糖酵解可能有助于改善和发现针对癌症的新策略。研究表明，糖酵解途径产生可三磷酸腺苷（ATP），而ATP 水解释放的能量使着丝粒微管（着丝粒纤维）向细胞纺锤体极端延伸，进而促进细胞有丝分裂［4］。着丝粒蛋白（CENPU）是有丝分裂阶段染色体分离的主要成分，CENPU 是CENP家族一员，又称为骨髓增生异常/髓样白血病因子1相互作用蛋白（MLF1IP）、KHSVLNA相互作用蛋白1（KLIP1）［5］。研究显示，下调CENPU 表达可抑制恶性肿瘤进展［6］。TCGA 数据库显示，MLF1IP 即CENPU 在胃癌组织中异常高表达，但其在胃癌中的作用尚未明确。2020 年5 月—11 月，我们探讨了CENPU对胃癌细胞增殖、糖酵解的影响及机制，以期为临床精准治疗胃癌提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃上皮细胞GES-1、胃癌细胞系AGS、MKN45、HGC-27 均购自北京北纳创联生物技术研究院。RPMI1640 培养基购自武汉益普生物科技有限公司；Lipo-fectamineTM3000 转染试剂盒购自美国Invitrogen 公司；si-CENPU、si-CENPU-NC 序列引物序列均由上海生工生物工程技术有限公司合成；CCK-8 试剂盒试剂盒购自福州飞净生物科技有限公司；葡萄糖消耗（GC）、乳酸脱氢酶（LDH）、ATP、丙酮酸激酶（PK）、己糖激酶（HK）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒、兔抗人蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、转录激活因子3（STAT3）及β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体、山羊抗兔HRP 二抗均购自北京义翘神州科技股份有限公司。CO2细胞培养箱购自美国Thermo 公司；ELx800 型酶标仪、C1000型荧光定量PCR仪购自美国Bio-rad公司。

1.2 细胞培养 复苏并解冻GES-1、AGS、MKN45、HGC-27 细胞，于含10% 灭活胎牛血清（FBS）+90%RPMI1640 的培养液、37℃、5%CO2、95%O2培养箱中培养，每2～3 d换1次培养液，传代培养。

1.3 各细胞系中CENPU mRNA 表达测定 采用实时荧光定量PCR 法。分别取对数生长期的各细胞并提取总RNA、测浓度，以RNA 为模板行反转录反应，将所得cDNA 进行实时荧光定量PCR 反应。体系20 µL：10 µL ULtraSYBR mixture、2.0 µL cDNA、正反向引物各2.0 µL、4.0 µL H2O2；共40 个循环：95 ℃15 s、60 ℃60 s；溶解曲线60～95 ℃，每15 s 升温0.3℃。以β-actin 为内参，CENPU 正向引物：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向引物：5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'；β-actin 正向引物：5'-GCAGAAGTGCGAAGAGGAGG-3'，反向引物：5'-GCTTGATGGAGTTGTCGGTGTA-3'。 采用2-ΔΔCt方法计算各细胞中CENPU mRNA表达。

1.4 HGC-27 细胞分组及处理 选择1.2 结果中CENPU mRNA 表达最高的HGC-27 细胞为研究对象。取对数生长期的HGC-27 细胞，接种于24 孔板（2.5×104/孔），待细胞融合至70%～80%时，更换无FBS 的培养液培养，将细胞随机分为3 组：①阴性对照组（si-CENPU-NC 组）：先用无FBS 的培养液将LipofectamineTM3000 稀释，用消毒的移液枪头吸取5 µL LipofectamineTM3000 转染试剂溶入250 µL Opti-MEM 培养基，吹打混匀，静置5 min；用消毒移液枪头吸取10 µL 含si-CENPU 的溶液溶入250 µL Opti-MEM 培养基，吹打混匀，静置5 min；上述两种静置后的溶液放入同一EP 管中，吹打混匀，静置20 min，后将混合液全部转移到6 格板中的其中1 个小孔中，摇匀法晃动6格板，使细胞培养基与转染混合液充分混匀；②沉默CENPU 表达组（si-CENPU组）：操作同si-CENPU-NC 组；③同时将未经特殊处理细胞设置为空白对照组（NG 组）。各组细胞继续培养24 h，每组设置6个复孔，实验重复3次。

1.5 各组HGC-27细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。分别取1.4 各组HGC-27 细胞、消化，接种至24孔板（2.5×104/孔），分别于培养24 h 后严格按照CCK-8 试剂盒说明书加入CCK-8 试剂，继续培养2 h，检测570 nm 处各孔细胞光密度（OD）值。计算细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD 值/NG 组OD值）×100%，每组设置6个复孔，实验重复3次。

1.6 各组HGC-27 细胞克隆形成率测定 采用平板克隆实验。分别取1.4 各组HGC-27 细胞，于6 孔板（每孔500 个细胞），每组6 个复孔，于37 ℃、5%CO2、95%O2条件下培养15 d，4%多聚甲醛固定、0.25%结晶紫染色30 min；拍照并计算克隆形成率。克隆形成率（%）=克隆形成数/接种细胞数×100%。

1.7 各组HGC-27 细胞糖酵解过程关键指标测定 采用ELISA 法。分别取1.4各组HGC-27细胞，吸取细胞培养上清液，按照LD检测试剂盒说明书检测上清中GC、LD 含量及关键酶HK、PK 水平；将细胞消化，接种至24 孔板（2.5×104个/孔），用生理盐水洗涤细胞并制成细胞悬浮液，按照ATP 检测试剂盒说明书检测细胞中ATP 含量。以上操作严格按照ELISA试剂盒书进行操作。

1.8 各组HGC-27 细胞AKT/STAT3 通路相关蛋白表达检测 采用免疫印迹法。分别取1.4 各组HGC-27 细胞，以RIPA 裂解并提取总蛋白，电泳、转膜，放入脱脂奶粉溶封闭，分别加入LDHA（1∶500）、GLUT1（1∶500）、AKT（1∶500）、p-AKT（1∶500）、STAT3（1∶500）、p-STAT3（1∶500）及内参β-actin（1∶500）为一抗，过夜，加入HRP 标记山羊抗兔二抗（1∶1 000），室温孵育30 min，显影、定影，以各基因条带灰度值计算各目标基因蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料符合正态分布以xˉ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人胃癌不同细胞系中CENPU mRNA 表达比较 GES-1细胞、AGS、MKN45、HGC-27细胞中CENPU mRNA 相对表达量分别为1.00 ± 0.15、1.58 ±0.23、1.79±0.26、2.13±0.32，与GES-1细胞比较，AGS、MKN45、HGC-27 细胞中CENPU mRNA 表达均升高（P均＜0.05），且HGC-27 细胞中CENPU mRNA表达最高（P＜0.05）。因此选择HGC-27 细胞进行后续实验。

2.2 各组HGC-27 细胞增殖情况比较 NG 组、si-CENPU-NC 组、si-CENPU 组HGC-27 细胞增殖抑制率分别为0、（0.32 ± 0.03）%、（18.96 ± 2.87）%，与NG 组、si-CENPU-NC 组比较，si-CENPU 组HGC-27细胞增殖抑制率升高（P均＜0.05）。

2.3 各组HGC-27 细胞克隆形成率比较 NG 组、si-CENPU-NC 组、si-CENPU 组HGC-27 细胞克隆形成率分别为（83.27±12.73）%、（85.95±12.89）%、（20.35 ± 3.01）%，与NG 组、si-CENPU-NC 组比较，si-CENPU 组HGC-27 细胞克隆形成率均降低（P均＜0.05）。

2.4 各组HGC-27 细胞糖酵解过程关键指标水平比较 与NG 组、si-CENPU-NC 组比较，si-CENPU 组HGC-27 细胞GC、LDH、ATP 水平及糖酵解关键酶HK、PK水平均降低（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组HGC-27细胞GC、LDH、ATP、HK、PK水平比较（xˉ±s）

2.5 各组HGC-27 细胞AKT/STAT3 通路蛋白表达比较 NG 组、si-CENPU-NC 组、si-CENPU 组p-AKT/AKT 相对表达量分别为0.56 ± 0.09、0.58 ± 0.08、0.33 ± 0.05，p-STAT3/STAT3 相对表达量分别为0.89±0.13、0.91±0.15、0.52±0.09，与NG 组、si-CENPU-NC 组比较，si-CENPU 组HGC-27 细胞p-AKT/AKT、p-STAT3/STAT3 表达均降低（P均＜0.05）。

3 讨论

癌细胞有丝分裂是促进肿瘤进展的关键因素之一，DNA 在有丝分裂过程中可组装成大的蛋白质载体即着丝粒，进而为细胞在有丝分裂中提供移动动力。CENPU 是CENP 家族成员之一，可以募集其他CENPs 如CENP-A 等及着丝粒，促进癌细胞分裂［7-8］。王欣欣［9］研究显示，CENPU 在肺癌组织中异常高表达，且可促进肺癌细胞增殖进而促进肿瘤进展。本研究查阅Ualcan 数据库（http：//ualcan. path. uab.edu/analysis. html）结果显示，MLF1IP 即CENPU 在胃腺癌组织中异常高表达，基于此本研究分析CENPU 在AGS、MKN45、HGC-27等不同胃癌细胞系中的表达情况。结果显示，与正常胃上皮细胞GES-1 细胞比较，AGS、MKN45、HGC-27 等胃癌细胞中CENPU mRNA 水平异常高表达，与数据库中表达趋势一致，且HGC-27 细胞中CENPU mRNA 水平最高。因此本研究以HGC-27 细胞进行后续实验，探究下调CENPU表达对胃癌细胞生物学行为及代谢的影响。

肿瘤细胞过度增殖是肿瘤进展关键因素［10］。本研究结果显示，与NG 组、si-CENPU-NC 组比较，si-CENPU 组HGC-27 细胞增殖抑制率升高，克隆形成率降低。说明抑制CENPU表达可能抑制HGC-27细胞增殖。癌细胞异常代谢是癌症发生发展的主要原因之一，为维持肿瘤细胞生存及满足大分子合成需要，肿瘤细胞在缺氧或有氧条件下，将其能量代谢方式转变为糖酵解过程，为满足癌细胞迅速增殖对能量的需求，癌细胞对葡萄糖的摄取量及消耗量均增加，并产生大量LDH，累积的LDH 可导致酸性微环境，细胞外基质在酸性环境中变得相对不稳定，进而促进癌细胞转移；此外，在糖酵解过程中有多种限速酶如PK、HK 等，直接影响糖酵解途径［11-13］。研究表明，糖酵解途径产生产生的ATP 水解释放的能量，使着丝粒微管（着丝粒纤维）向细胞纺锤体极端延伸，进而促进细胞有丝分裂［4］。CENPU 是着丝粒蛋白家族成员之一。本研究结果显示，与NG 组、si-CENPU-NC 组比较，si-CENPU 组HGC-27 细胞GC、LDH、ATP 水平及糖酵解关键酶HK、PK 水平均降低。说明抑制CENPU表达可能抑制HGC-27细胞糖酵解过程。

癌细胞的生长和能量代谢过程复杂，AKT/STAT3 通路细胞内重要的信号转导途径，在肿瘤中AKT异常活化并发生磷酸化反应生成p-AKT，进而促进下游基因STAT3 活化并发生磷酸化反应生成p-STAT3，调控肿瘤细胞增殖、能量代谢［14-15］。周立强等［16］研究显示，抑制AKT通路活化可抑制胃癌细胞增殖及糖酵解过程。王胜男等［17］研究显示，抑制AKT/STAT3通路活化可抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。本研究结果显示，与NG 组、si-CENPU-NC 组比较，si-CENPU组HGC-27细胞p-AKT/AKT、p-STAT3/STAT3水平均降低。与既往研究结果一致，说明沉默CENPU表达可抑制HGC-27细胞增殖及糖酵解，可能通过抑制AKT/STAT3通路活化实现。

综上所述，沉默CENPU 表达可抑制HGC-27 细胞增殖及糖酵解，其机制可能通过抑制AKT/STAT3通路活化实现。