黄连素通过诱导G0/G1 或G2/M 期阻滞抑制前列腺癌细胞株PC-3 的增殖作用分析

陆巍 廉吉虎 王潇然 高庆圆 刘炳辰 杜杉杉

前列腺癌是泌尿外科常见肿瘤之一,也是影响男性健康与生活质量的恶性肿瘤。针对早期前列腺癌目前临床的首选治疗方案主要为手术病灶切除治疗,而化疗则为晚期前列腺癌的主要治疗方式。统计大量临床肿瘤病例随访资料可知：长期化疗给晚期癌症患者带来大量的毒副反应和经济负担,因此找寻更安全与更经济的抗癌药物是目前肿瘤领域所面临的重要问题及重要挑战。黄连素,又名小檗碱,是中药黄连的主要活性成分。近来研究［1］发现黄连素在多种心内血管疾病、糖尿病及抗肿瘤治疗中均有着较好的临床应用价值。黄连素作为一种传统的抗炎药,能否通过抑制恶性肿瘤诱导的宿主炎症反应进而抑制肿瘤的进展是目前临床研究的一大热点。与传统的一些化疗药物进行比较,天然化合物黄连素具有安全性更高、更经济的特点,其在前列腺癌治疗方面的应用亟待探索。目前,国内外多项研究［2,3］对黄连素的认知仅停留在细胞水平和分子水平上,本文以前列腺癌细胞株PC-3 为研究对象,分析黄连素的抗肿瘤作用及机制,为临床抗肿瘤辅助药物的研发提供新的思路、方法及依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人前列腺癌PC-3 细胞株从美国模式培养物保藏所获得(马纳萨斯,维吉尼亚州,美国),并在含10%胎牛血清的DMEM 培养基中进行培养(Hyclone 公司,洛根,犹他州,美国)。

1.1.2 药物 黄连素购自西马-奥尔德里奇(路易斯,密苏里州,美国)。黄连素的纯度≥98%,溶解于二甲亚砜中(σ-奥尔德里奇),稀释至实验所需浓度。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖抑制实验 采用MTT 法：选取处于对数生长期的前列腺癌PC-3 细胞株,将所有细胞株放置于DMEM 培养基中进行培养,培养基环境为在5%的CO2中添加10%的胎牛血清。当细胞密度达到70%时,添加不同浓度的黄连素来对细胞进行处理。在黄连素组中,前列腺癌PC-3 细胞株在5、10、20、50 μM的黄连素中培养24 h,在未加入黄连素组中,列腺癌PC-3 细胞株在不加黄连素中培养24 h。细胞的存活率通过MTT 试验进行测量。细胞96 孔板在酶标仪上读取(赛默科技,罗克福德,伊利诺伊州,美国),测试波长为490 nm,参考波长为570 nm,在波长490 nm 处测吸光度(A),光密度(OD),以上各组实验重复3 次。抑制率(%)=(1-实验组A 值/对照组A 值)×100%。

1.2.2 前列腺癌PC-3 细胞株凋亡率 采用流式细胞术(FCM)进行检测：根据制造商的说明书以碘化酸/丙酸碘化(PI)双染色法进行检测(Santa Cruz 生物技术公司,Santa Cruz,加利福尼亚州,美国)。用磷酸-缓冲盐水冲洗细胞,用不同浓度的黄连素(5、10、20、50 μM)处理细胞24 或48 h,随后在结合缓冲液(10 mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸-氢氧化钠,pH 值7.4；25 mM氯化钙和144 mM 氯化钠)中进行再悬浮。随后,加入膜联蛋白V(0.1 μg/μl)和PI(0.05 μg/μl)染料,并将细胞在冰中、黑暗下培养30 min。然后将细胞进行荧光活化细胞分类(FASS)分析；样品由流式细胞仪细胞分选系统(BD 生物科技,圣何塞,加利福尼亚州,美国)进行检测,最后进行凋亡率的计算分析。

1.2.3 前列腺癌PC-3 细胞株周期检测 前列腺癌PC-3 细胞株处理好以后所有黄连素加入浓度均为20 μM,实验分组为：对照组(药物孵育0 h)；药物孵育24 h、药物孵育48 h；药物孵育72 h。每组3个复孔。然后进行收集细胞、洗涤并固定细胞、染色孵育,最后进行流式检测和结果分析。结果数据采用Flowjo 软件进行。

1.2.4 前列腺癌PC-3 细胞株中FAS 蛋白的表达测定测定步骤为首先进行蛋白印记(所有前列腺癌PC-3细胞株处理好以后在不同时间点加入黄连素,探究黄连素不同浓度对蛋白表达的影响,则在相同时间内加入不同浓度的黄连素,各实验组黄连素的终浓度为 5、10、20、50 μM,另外设对照组,加入相同体积的药物溶解介质,所有标本均放入CO2培养箱中培养26 h。)、其次所有培养标本进行细胞总蛋白提取、蛋白定量的测定、制胶、电泳、转膜,进行免疫反应,然后进行显影和定影,采用蛋白免疫印迹(WB)方法检测前列腺癌PC-3 细胞株中FAS 蛋白的表达,最后进行数据处理和图片分析,扫描下保存的图片采用Image J分析软件进行灰度分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度黄连素对前列腺癌PC-3 细胞株增殖抑制率、凋亡率的影响 黄连素组前列腺癌PC-3 细胞株增殖抑制率及凋亡率均高于未加入黄连素组,且随着黄连素浓度的上升,前列腺癌PC-3 细胞株增殖抑制率及凋亡率均逐渐升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 不同浓度黄连素对前列腺癌PC-3 细胞株增殖抑制率、凋亡率的影响(,%)

表1 不同浓度黄连素对前列腺癌PC-3 细胞株增殖抑制率、凋亡率的影响(,%)

注：与未加入黄连素组比较,aP＜0.05；与5 μM 比较,bP＜0.05；与10 μM 比较,cP＜0.05；与20 μM 比较,dP＜0.05

2.2 黄连素孵育时间对前列腺癌PC-3 细胞株细胞周期的影响 黄连素孵育24 h组、黄连素孵育48 h组、黄连素孵育72 h组的前列腺癌PC-3 细胞株在G0/G1期比例高于对照组,在S 期与G2/M 期比例低于对照组,且随黄连素孵育时间增加,前列腺癌PC-3 细胞株在G0/G1期比例明显增加,在S 期与G2/M 期比例逐渐降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 黄连素孵育时间对前列腺癌PC-3 细胞株细胞周期的影响(,%)

表2 黄连素孵育时间对前列腺癌PC-3 细胞株细胞周期的影响(,%)

注：各组比较,P＜0.05

2.3 同浓度黄连素不同孵育时间对前列腺癌PC-3 细胞株中FAS 蛋白的影响 在加入固定浓度20 μM 黄连素进行药物孵育中,随着孵育时间的延长,前列腺癌PC-3 细胞株中FAS 蛋白浓度逐渐降低。见图1。

图1 不同孵育时间对前列腺癌PC-3 细胞株中FAS 蛋白的影响

2.4 不同浓度黄连素孵育相同时间对前列腺癌PC-3 细胞株中FAS 蛋白的影响 在孵育相同时间前提下,加入黄连素前后列腺癌PC-3 细胞株中FAS 蛋白显著降低,且随着浓度的增高,FAS 蛋白呈逐渐降低。见图2。

图2 不同浓度黄连素对前列腺癌PC-3 细胞株中FAS 蛋白的影响

3 讨论

黄连素是一种稳定存在的季铵型异喹啉类生物碱,目前临床上主要用于治疗肠道感染［4］。多项研究表明［5-7］,在肿瘤细胞周期停滞与细胞的凋亡过程中,黄连素可能通过上调周期蛋白激酶抑制因子与下调一系列周期蛋白依赖的激酶以及周期蛋白起着一定的诱导作用。2010年,有相关文献［8］指出：低浓度黄连素能够通过诱导DNA 损伤(DNA 双链断裂即DSB),激活p53-p21 通路导致人成骨肉瘤U2OS 细胞发生G1期停滞,而较高浓度的黄连素(50 μg/ml)则能诱导G2/M 期停滞,但黄连素诱导的G2/M 期停滞并不依赖p53-p21通路。此前,研究证实［9］黄连素可通过下调FAS、CDK1、细胞周期蛋白B1、CDC25C 以及上调Weel、14-3-3σ 的表达,诱导其他几种肿瘤细胞发生G2/M 期停滞,但具体的上游信号通路还不清楚。

本研究以人前列腺癌PC-3 细胞株为细胞模型,结果显示：黄连素组前列腺癌PC-3 细胞株增殖抑制率及凋亡率均高于对照组,且随着黄连素浓度的上升,前列腺癌PC-3 细胞株增殖抑制率及凋亡率均逐渐升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。提示,黄连素对前列腺癌PC-3 细胞株具有显著的抑制增殖作用,另一方面,加入20 μM 黄连素处理后,黄连素孵育24 h组、黄连素孵育48 h组、黄连素孵育72 h组的前列腺癌PC-3细胞株在G0/G1期比例高于对照组,在S 期与G2/M 期比例低于对照组,且随黄连素孵育时间增加,前列腺癌PC-3 细胞株在G0/G1期比例明显增加,在S 期与G2/M 期比例逐渐降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。由此提示：黄连素对前列腺癌PC-3 细胞株细胞周期的分布具有显著的影响,尤其是高浓度时可明显阻滞G2/M 期。脂肪酸合FAS 属于大分子蛋白复合物的一种,主要存在于机体的细胞质内,在生物体内源性脂肪酸的合成中有着至为关键的作用［10］。而有相关文献提出［11,12］：FAS 在肥胖者的肝脏、脂肪细胞及各肿瘤细胞中都呈现出异常高表达,且FAS 的表达与预后呈负相关存在,表达越高提示预后不良风险越高。而本研究进一步行WB 检测分析得,黄连素不同孵育时间及不同浓度均对前列腺癌PC-3 细胞株中FAS 蛋白存在影响,且随着孵育时间的延长与浓度的增加,FAS 蛋白含量均逐渐减少,考虑原因可能为：黄连素通过抑制FAS 中β 原酮脂酰合成酶从而对DNA 的复制起到了抑制作用,阻断了肿瘤细胞生长的能量来源,诱导细胞凋亡,进而抑制了细胞的增殖与生长。

综上所述,黄连素可促进前列腺癌细胞株PC-3 的细胞凋亡,通过改变细胞周期抑制其增殖生长,具有抗肿瘤活性,而促进细胞凋亡和抑制增长生长可能与引起细胞G2/M 期阻滞和抑制前列腺癌PC-3 细胞株中FAS 蛋白表达有关。但关于FAS 蛋白或其蛋白通路与细胞G2/M 期阻滞之间的联系还有待进一步深入研究。