不同菌种对太和豆豉的品质及其挥发性风味化合物变化的研究

何维，安天星，余玲，廖柯，唐扬，刘迎涛，邓婷，黄才森，赵志峰

(1.四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065；2.成都太和坊酿造有限公司，成都 610501)

豆豉通常是以黄豆、黑豆等豆类物质为原料，经浸泡、蒸煮、制曲、拌料、后发酵而成[1]。按照微生物发酵的种类不同，可分为毛霉型、曲霉型、根酶型、细菌型及脉胞菌型五大类，其中毛霉豆豉以重庆潼川、四川永川、四川太和豆豉为典型代表[2-3]。豆豉在发酵成熟的过程中发生着复杂的化学变化，其中主要包括还原糖、蛋白质、脂肪酸等含量的变化，使豆豉口感细腻绵软[4-5]。其中最主要的变化是豆豉中的蛋白质被分解为小分子的游离氨基酸与多肽，不但提高了食品的营养价值，还决定了发酵食品的滋味与风味物质的形成[6-11]。毛霉豆豉因具有独特的多种生理活性物质与独特的风味，且具有一定的药用价值与食用价值，深受消费者的欢迎。

毛霉型豆豉是我国传统的大豆发酵制品，一直深受人们的喜爱[12]。且大豆在微生物作用下不仅能很好地保留大豆原有的营养成分，而且在其他微生物(如乳酸菌、酵母菌)的发酵过程中能产生一定量的大豆异黄酮、大豆抗氧化肽、大豆低聚糖、活性酶和亚麻酸等活性成分，具有抗癌、抗氧化、降血脂、调理肠胃等生理功能[13-14]。豆豉发酵过程中还原糖、氨基酸、风味物质等变化规律和特点有利于分析其产品品质形成的机理。目前，四川太和豆豉产品品质形成机理还未见报道。

本试验将总状毛霉(Mucorracemosus)、米曲霉、总状毛霉与米曲霉混合后以及接种于黄豆中，通过测定不同发酵时期的还原糖、总酸、氨基态氮，再通过气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法测定不同发酵时期豆豉中风味物质含量的变化。探讨不同菌种在太和豆豉发酵过程中基本成分的发酵规律，从而为进一步推广高品质的毛霉型太和豆豉提供可靠的研究数据支持，为毛霉豆豉工业化、标准化生产提供研究数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

总状毛霉M-THF-02：已保藏于中国典型培养物保藏中心；米曲霉3.042：购于山东沂源康源生物科技有限公司。

黄豆：产地黑龙江省讷河市。

硝酸银、氢氧化钠、甲醛、三氯乙酸、乳酸钠、葡萄糖等试剂(均为分析纯)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、麦麸培养基：成都鸿盛达科技有限公司。

1.2 仪器与设备

试验仪器见表1。

表1 主要仪器设备一览表Table 1 The main instruments and equipment

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1.3 试验方法

1.3.1 不同菌种豆豉的制备

纯种毛霉豆豉的制作：大豆除杂→清洗→浸泡→常压蒸煮→冷却→接种→前发酵(25 ℃、72 h)→拌和(10%食盐、1%白酒、)→入池后发酵(常温发酵时间300 d以上)→成品。

米曲霉豆豉的制作：大豆除杂→清洗→浸泡→常压蒸煮→冷却→接种→前发酵(28 ℃、42 h)→拌和(10%食盐、1%白酒)→入池后发酵(常温发酵时间200 d以上)→成品。

米曲霉与毛霉混合发酵豆豉的制作：大豆除杂→清洗→浸泡→常压蒸煮→冷却→接种→前发酵(前期发酵温度为25 ℃，48 h，后期发酵温度为28 ℃)→拌和(10%食盐、1%白酒)→入池后发酵(常温发酵时间250 d以上)→成品。

将上述制备好的豆豉每隔30 d取样测定其氨基态氮、总酸、还原糖含量以及风味物质含量。

1.3.2 理化指标的测定

1.3.2.1 豆豉中还原糖含量的测定

以葡萄糖的含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，回归方程：y=0.5002x-0.001，相关系数R2=0.9996 。采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定豉曲的还原糖含量。

1.3.2.2 豆豉中氨基酸态氮、总酸含量的测定

参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》，采用甲醛法测定氨基酸态氮与总酸含量。

1.3.2.3 豆豉中香味物质的提取方法

香味物质采用顶空固相微萃取技术进行提取[15]，取不同发酵时期的豆豉样品5.0 g于20 mL的顶空瓶内，盖上瓶盖，置于60 ℃恒温水浴锅中平衡20 min，采用固相微萃取装置将萃取头手动插入顶空瓶中，顶空吸附20 min后，直接将萃取头注入气相色谱仪进样口处，在230 ℃条件下脱附5 min。

1.3.2.4 香味物质的分析鉴定方法

采用气相色谱-质谱分析法(GC-MS)对提取出来的香味物质进行分析。

气相色谱(GC)条件：采用 DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，用氦气作载气，流速为1.0 mL/min。升温程序：色谱柱起始柱温40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升到230 ℃，保持5 min。

质谱(MS)条件：采集方式：全扫描，质量采集范围 40～400 m/z；电离方式：电子轰击(EI)；发射能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；接口温度：230 ℃。

1.3.2.5 豆豉香味物质分析定量方法

采用面积归一法定量，通过豆豉中各组分的峰面积与各组分峰面积总和的比值来表示，按下式计算各个组分的相对含量：

式中：Ci为待测组分i的含量；Ai为待测组分i的峰面积；Si为各组分峰面积之和。

2 结果与分析

2.1 不同菌种豆豉发酵过程中理化指标的变化

由图1～图3中3种不同菌种豆豉在发酵过程中的变化趋势可以看出，3种豆豉在发酵过程中总酸与氨基态氮的含量都呈现出上升的趋势，而还原糖的生成速率呈现下降的趋势，其主要有两方面的原因：一方面，由于微生物的生长，消耗速率增加，从而导致豆豉还原糖含量降低[16]；另一方面，由于豆豉本身在发酵过程中环境所带微生物代谢糖类等物质形成乳酸和乙酸等有机酸，这也是导致还原糖含量降低的原因[17]。3种豆豉在常温发酵过程中，氨基态氮含量、总酸含量由高到低的顺序为米曲霉豆豉>毛霉与米曲霉混合发酵豆豉>毛霉豆豉；其主要原因是毛霉菌种与米曲霉发酵过程中产生的酶活力不同，毛霉豆豉主要以酸性蛋白酶为主；米曲霉豆豉主要以产生中性蛋白酶为主，这些主要成分的差异也有可能导致这3种豆豉口味不同，毛霉豆豉的风味明显高于米曲霉豆豉。

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2.2 不同菌种发酵豆豉中香味物质分析结果

图4 不同菌种发酵豆豉香味物质总离子流图Fig.4 Total ion flow diagram of flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

表2 不同菌种发酵豆豉香味物质对比Table 2 Comparison of flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

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由图5和图6可知，豆豉1号共检测出55种香味物质，其中烃类10种，占总相对含量的2.83%；醇类10种，占总相对含量的37.03%；醚类1种，占总相对含量的0.44%；酮类2种，占总相对含量的0.24%；醛类6种，占总相对含量的8.05%；酸类1种，占总相对含量的3.45%；酯类20种，占总相对含量的46.98%；吡咯类1种，占总相对含量的0.13%；吡嗪类2种，占总相对含量的0.76%；其他类2种，占总相对含量的0.10%。豆豉2号共检测出64种香味物质，其中烃类20种，占总相对含量的3.7%；醇类11种，占总相对含量的25.73%；醚类1种，占总相对含量的9.51%；酮类1种，占总相对含量的0.07%；醛类6种，占总相对含量的6.20%；酸类2种，占总相对含量的4.08%；酯类21种，占总相对含量的50.54%；吡咯类1种，占总相对含量的0.04%；吡嗪类1种，占总相对含量的0.12%。豆豉3号共检测出76种香味物质，其中烃类26种，占总相对含量的18.54%；醇类10种，占总相对含量的17.35%；醚类3种，占总相对含量的17.62%；酮类2种，占总相对含量的1.03%；醛类10种，占总相对含量的6.98%；酯类22种，占总相对含量的37.91%；吡咯类1种，占总相对含量的0.45%；其他类2种，占总相对含量的0.11%。

图5 不同菌种发酵豆豉中不同种类香味物质相对含量统计图Fig.5 Statistical chart of relative content of different flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

图6 不同菌种发酵豆豉中不同种类香味物质种数统计图Fig.6 Statistical chart of species number of differentflavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

这3种不同菌种发酵的豆豉主要的香味物质种类为烃类、醇类、醚类、酮类、醛类、酯类和吡咯类；3种豆豉香味物质种类占比最高的均为酯类。

2.3 不同菌种发酵豆豉中主体香味物质分析

为了进一步分析3种不同菌种发酵的豆豉香味物质的差异，选取每种豆豉中检测到的香味物质相对含量≥1%的物质单独剔除进行分析，结果见表3。

表3 不同菌种发酵豆豉主体香味物质分析Table 3 Analysis of main flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

由图7可知，3种豆豉主体香味物质种数分别为14，19，17种，主体物质总相对含量分别为84.49%、93.38%和92.27%。

图7 不同菌种发酵豆豉主体香味物质总相对含量和种数分析Fig.7 Analysis of total relative content and species number of main flavor compounds in fermented black beans fermented by different strains

3种豆豉所含主体香味物质种类均包括烃类、醇类、醛类和酯类，除此以外，豆豉1号所含主体香味物质种类还包括醚类，豆豉2号包括醚类和酸类，豆豉3号包括酸类。(+)-柠檬烯为3种样品共有的烃类主体香味物质，(+)-柠檬烯具有类似柠檬的香味；芳樟醇为3种样品共有的醇类主体香味物质，芳樟醇具有铃兰香气；苯甲醛和苯乙醛为3种样品共有的醛类主体香味物质，其中苯甲醛具有苦杏仁、樱桃及坚果香，苯乙醛具有类似风信子的香气，稀释后具有水果的甜香气；己酸乙酯、苯乙酸乙酯、十六酸乙酯和安息香酸乙酯为3种样品共有的酯类主体香味物质，其中己酸乙酯具有酒曲香、菠萝香型的香气，苯乙酸乙酯具有浓烈而甜的蜂蜜香气，十六酸乙酯具有微弱蜡香、果爵和奶油香气，安息香酸乙酯具有水果气味。

综上所述，3种豆豉所含主体香味物质种类均包括烃类、醇类、醛类和酯类，除此以外，豆豉1号所含主体香味物质种类还包括醚类，豆豉2号包括醚类和酸类，豆豉3号包括酸类。豆豉1号呈现出较浓的茴香、酒曲香和稍淡的柠檬香、铃兰香以及淡淡的水果香、油脂香；豆豉2号呈现出较浓的微带果香的酒香和稍淡的茴香、酒曲香以及淡淡的果香和铃兰香；豆豉3号呈现出浓郁的酒香和稍淡的酒曲香、辛辣苹果白兰地香气以及淡淡的水果香和青草香。

3 结论

本文以毛霉豆豉、米曲霉豆豉、毛霉+米曲霉型豆豉为研究对象，研究3种不同菌种对太和豆豉中的还原糖、总酸、氨基态氮理化指标的影响，以及进行发酵过程中风味物质变化的测定。结果显示：3种不同菌种对在豆豉发酵1～7个月过程中，米曲霉豆豉、毛霉豆豉、米曲霉+毛霉豆豉中的总糖含量呈逐渐下降的趋势，而总酸与氨基态氮的含量呈现上升的趋势；其主要原因是豆豉在后发酵过程中在蛋白水解酶的作用下将蛋白质与多肽进一步分解为游离氨基酸。采用GC-MS测定3种不同菌种发酵的太和豆豉中的挥发性成分，其中在毛霉豆豉中检测出76种挥发性成分，米曲霉豆豉中有55种挥发性成分，米曲霉+毛霉豆豉中有64种挥发性成分，3种豆豉中最主要的成分包括烃类、醇类、醚类、酮类、醛类、酯类和吡咯类。毛霉豆豉的风味物质明显高于米曲霉豆豉与毛霉+米曲霉豆豉，其原因可能是毛霉豆豉发酵周期长，成熟期较长，其酶主要产酸性蛋白酶，而米曲霉以中性蛋白酶为主；但其品质与口感明显高于米曲霉豆豉，这也是消费者喜欢毛霉豆豉的原因。通过对不同菌种在太和豆豉发酵过程中理化指标的动态分析以及风味物质的分析，从而对太和豆豉的发酵过程有了进一步的了解，同时也为豆豉发酵过程奠定了理论基础。研究表明，传统发酵食品如泡菜、豆酱、酱油等食品的风味物质主要取决于发酵过程中酵母菌与乳酸菌的作用[18-19]。对豆豉发酵后菌群研究表明，乳酸菌与酵母在豆豉发酵后也占主体地位，而且对豆豉色泽、香味起着重大的意义[20]。太和豆豉风味的形成是微生物代谢及食物组分相互作用的结果，其微生物菌群的变化和各种风味物质形成的机理还需进一步探讨与研究，以期为指导豆豉的工业化与规模化生产提供更多的理论基础。