NDV基因Ⅶ型DNA纳米颗粒疫苗初探

吴耀棠，梁健鹏，林思娴，刘宏梽，向 斌，丁 铲，徐成刚，廖 明，任 涛

（1.华南农业大学兽医学院，广州 510642；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

新城疫（newcastle disease, ND）具有高致病性、高死亡率，是一种由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起禽类发病、致死的急性、高度接触性传染病[1]。NDV属于禽副黏病毒1型（APMV-1）[2]，发病时主要以呼吸道、消化道黏膜出血为主。基因Ⅶ型毒株是我国目前新城疫病毒的流行株，Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ等其他基因型株在一些地区呈现零星散发[3]，在我国，广东、江苏两省的许多鹅群、鸭群陆续有NDV感染并造成严重的发病、死亡，有些表现带毒呈隐性感染[4]，直至目前仍然没有有效的药物对新城疫进行治疗，种种现象表明该病仍然是最危险的禽病之一[5]。诱导高水平的黏膜免疫在感染早期、初始部位彻底清除病原体对于动物机体的免疫十分重要。纳米颗粒药物传递系统可以控制和维持药物在定位部位的释放[6]，优势在于靶向性以及纳米颗粒包封的药物在疾病部位的有效性[7]。壳聚糖是一种安全可靠的碱性天然生物活性多糖，其来源丰富、生物相容性好、可降解和分解产物无毒[8-9]，并且其粒径小，表面积大，与生物膜有较高的黏着性等优点，已成为广泛应用的新型药用辅料之一，作为微球、微囊、纳米颗粒等药物载体的研究也日益受到重视[10]。国内外很少有家禽病毒制备纳米颗粒疫苗研究的报道，本试验以壳聚糖为载体，TPP和MgSO4为交联剂，采用离子交联法，制备DNA纳米颗粒疫苗，优化制备途径，制备出粒径小、分散性好的纳米颗粒，使其在机体内缓慢释放，解决了黏膜免疫部位的IgA抗体低和疫苗利用度低的问题，为家禽新型DNA疫苗的研制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验动物与鸡胚 9～11日龄SPF鸡胚和2周龄SPF鸡，均为广东省新兴大华农禽蛋有限公司产品，试验期间SPF鸡饲养于禽病感染实验室的负压隔离器中。

1.2 试验毒株、细胞、抗体及载体 新城疫病毒rGM毒株、pCAGGS表达载体、DF-1细胞和DH5α感受态细胞为本试验室保存；兔抗鸡新城疫F多克隆抗体由本实验室制备。

1.3 主要试剂及仪器 壳聚糖（脱乙酰度≥85%，低分子质量级），三聚磷酸钠购自Sigma；限制性内切酶NheⅠ和EcoRⅠ、DNA Marker购自TaKaRa公司产；E.Z.N.A Endo-free Plasmid DNA Mini Kit Ⅱ购自OMEGA公司；超声波细胞破碎仪为南京先欧仪器制备有限公司；Master cycler Personal PCR仪购自德国Eppendorf公司；纳米粒度分布仪BT-90购自丹东百特仪器有限公司；JS94H型微电泳仪购自上海中晨数字技术设备有限公司。

1.4 rGM的繁殖及EID50采用参考文献[3]的方法，对rGM毒株进行繁殖培养、纯化及EID50的测定。

1.5 F基因cDNA的获取 以提取的NDV rGM株RNA为模板，反转录成cDNA。反转录反应体系（20 μL）为：RNA提取液12.5 μL，5× MLV Buffer 4.0 μL，M-MLV反转录酶1.0 μL，dNTPs 1.0 μL，RNase 抑制剂 0.5 μL，反转录引物R:O 1.0 μL。置于42℃水浴锅水浴1 h，将所得反应产物cDNA用于PCR扩增。

1.6 PCR产物的克隆与pCAGGS-F的构建 取上述的cDNA用于扩增F基因，反应体系（50 μL）：Premix Ex Taq 25 μL，cDNA模板2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL， ddH2O 21.5 μL。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸100 s，共35个循环；72℃再延伸10 min，4℃保存，PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。用常规方法将F片段克隆至pMD19-T载体上，命名为pMD19-T-F。用EcoRⅠ和NheⅠ双酶切pCAGGS与pMD19-T-F得到大小1700 bp的F片段和pCAGGS载体的线性片段，然后用T4 DNA连接酶连接，得pCAGGS-F。将连接产物加入DH5α感受态细胞中，涂布于氨苄抗性的LB平板上，筛选阳性克隆，挑单菌落，对送测序鉴定的菌液进行过夜培养，质粒抽提。以上所用引物为：rGM-F-F：5'-CGGAATTCGCCACCATGGGCTTCAAACCTTC TACC-3'；rGM-F-R：5'-CGGCTAGCTCATGCTC TTGTAGTGGCTCT-3'。

1.7 重组质粒pCAGGS-F鉴定 酶切反应体系（50 μL）为：10× Buffer 5 μL，重组质粒pCAGGS-F2μL，EcoRⅠ酶1 μL，NheⅠ酶1 μL，ddH2O 41 μL。在37℃水浴锅中酶切20 min后，于1%凝胶电泳观察结果。将DF-1细胞以适当密度接种于6孔板中生长，置于37℃、5%CO2的条件下培养，转染步骤按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行，将pCAGGS-F转染24 h后，进行间接免疫荧光鉴定。

1.8 DNA纳米颗粒疫苗制备 在50 mL锥形瓶中加入5 mL不同浓度（0.5 ～2 mg/mL）的壳聚糖溶液，600 rpm搅拌5 min；往锥形瓶四周缓慢滴加2 mL不同浓度（100 ng/μL～1 000 ng/μL）pCAGGS-F质粒溶液，搅拌3 min；将搅拌速度调至700～1 000 rpm，搅拌3 min；继续滴加1 mL不同浓度（0.5 mg/mL～2 mg/mL）MgSO4溶液和2 mL不同浓度（0.5 mg/mL～2 mg/mL）TPP溶液，在1000 rpm，磁力搅拌下往锥形瓶四周缓慢滴加，并保持在10 min滴完，此时溶液会出现一种淡蓝色乳光；；离心后弃上清液，用无菌ddH2O洗涤沉淀，超声破碎直到沉淀溶解，真空冷冻干燥得DNA纳米颗粒疫苗固体粉末，测定包封率，Zeta电位，筛选最优条件，并考察其稳定性。

1.9 免疫效果分析 取50只2周龄SPF鸡，共分为5组，每组10只。试验组Ⅰ：对照组，每只后腿肌肉多点注射200 μL PBS溶液；试验组Ⅱ：每只点眼滴鼻免疫200 μL壳聚糖-TPP溶液；试验组Ⅲ：每只后腿肌肉多点注射200 μL（100 μg）pCAGGS-F质粒；试验组Ⅳ：每只于后腿多点肌肉注射200 μL，含100 μg DNA的纳米颗粒溶液；试验组Ⅴ：每只点眼滴鼻免疫200 μL（100 μg）DNA的纳米颗粒溶液；所有组在一免后两周，以相同剂量加强免疫一次。二免后两周每组鸡通过点眼滴鼻接种100 μL 103EID50新城疫rGM病毒，连续观察14 d，记录所有鸡的临床情况，统计死亡鸡、发病鸡的情况。在攻毒后的第3、5、7、9 d和11 d采集咽和泄殖腔拭子，检测排毒情况。试验组的病死鸡立即解剖，观察病变，拍照留存，做好记录。

2 结果

2.1 EID50的测定 EID50为107.26/0.1 mL，即将病毒悬液做10-7.26倍稀释后，给每枚鸡胚接种0.1 mL，可以使50%的鸡胚感染。

2.2 pCAGGS-F重组质粒的构建 NDV F基因的菌液PCR扩增产物电泳后可见一条约1700 bp的条带，与预期片段大小相符（图1）。重组表达载体进行质粒抽提后，用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，可见2条约为4800 bp和1700 bp目的条带，与预期结果一致（图2）。IFA结果显示，阴性对照观察不到特异性荧光，而转染质粒pCAGGS-F的DF-1细胞可观察到特异性荧光，说明构建的质粒pCAGGS-F、pCAGGS-F/Nps可表达特异性的蛋白。

图1 新城疫病毒F基因的菌液PCR扩增Fig.1 PCR amplification of F gene of Newcastle disease virus

图2 pCAGGS-F的酶切鉴定Fig.2 Identification of pCAGGS-F by restriction enzyme digestion

2.3 优化条件筛选 固定其他因数不变，基于壳聚糖本身的特性，在pH4.5～6.5的范围内探讨制备出的纳米颗粒（见表1）。优化条件结果为pH6.0，壳聚糖浓度1.0 mg/mL，体积为5 mL；质粒浓度500 ng/μL，体积为2 mL；MgSO4浓度为1 mg/mL，体积为1 mL；TPP浓度1 mg/mL，体积为2 mL，整体质量比壳聚糖：MgSO4：TPP：DNA为5∶1∶2∶1时，包封率可达到一个较高的值，高于90%（见图4）。在纳米粒度分析中，多分散性PDI较小，呈较稳定的状态。储存稳定性分析结果冻干组与4℃纳米颗粒溶液组的平均粒径与PDI没有发生明显的变化，比较稳定（见图5）。

表1 纳米颗粒的粒径、Zeta电位及PDITable 1 Particle size, Zeta potential and PDI of Nanoparticles

图3 间接免疫荧光结果Fig.3 Indirect immuno fluorescence results

图4 不同因素对纳米颗粒包封率的影响Fig.4 Effects of different factors on encapsulation efficiency of nanoparticles

图5 纳米颗粒的粒径、PDI随时间的变化（n=3）Fig.5 Changes of particle size and PDI with time (n=3)

2.4 免疫效果分析 在一免28 d后的DNA纳米颗粒点眼滴鼻免疫组（Intraocular-nasal immunity, i.n）免疫的鸡有较高的IgG水平，抗体滴度都显著高于其他组（见图7）。在IgA的检测中，DNA纳米颗粒肌肉注射免疫组（Intramuscular immunity, i.m）检测到IgA的含量有一定的增加，泪液、气管液、胆汁及血清中IgA的动态增长曲线也相似，在一免后第14 d达到一个小高峰，第28 d达到最高峰，都显著高于其他免疫组，说明了该组可以诱导更快、更好的黏膜免疫应答，产生的IgA抗体可以起到抗病毒作用。新城疫rGM毒株以100 μL 103EID50剂量通过点眼滴鼻途径感染试验鸡（见图8），PBS组与壳聚糖-TPP组的死亡率为100%，攻毒rGM后腺胃乳头出血严重，病死鸡具有ND的典型病理变化（见图9），而DNA纳米颗粒疫苗点眼滴鼻组的保护率要高于pCAGGS-F组，为100%，其排毒情况见表2。

表2 拭子检测排毒情况Table 2 Detoxification by swab test

图6 免疫鸡IgA抗体的测定（n=3）Fig.6 Detection of IgA Antibody in Immunized Chickens (n=3)

图7 免疫鸡中和抗体水平变化Fig.7 Changes of neutralizing antibody level in immunized chickens

图8 攻毒保护试验存活率Fig.8 Survival rate of attack and protection test

图9 肌胃腺胃解剖图Fig.9 Muscle-stomach glandular-stomach anatomy

3 讨论

ND是由NDV引起禽类发病、致死的急性、高度接触性传染病，迄今为止NDV感染的禽类已超过250多种，给整个养禽行业带来严重影响。我国目前NDV流行株为基因Ⅶ型毒株，尤其是Ⅶd亚型毒株的流行给我国养禽业造成了巨大的经济损失，而市场上常用的ND疫苗株是由基因Ⅱ型毒株分离而来的，而刘秀梵等[11]研究证明，该基因Ⅱ型毒株与Ⅶ型毒株基因组的同源性只有82%左右，对黏膜有特殊的亲嗜性，通过呼吸道和消化道侵入机体[12]。为了提高更好的免疫保护效力，开发新城疫基因Ⅶ型的新疫苗具有非常广阔的应用前景。动物机体的呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道等黏膜表面集中了大量的免疫细胞、淋巴组织等，构成了有机体抵御病原微生物的第一道免疫屏障，诱导高水平的黏膜免疫在感染早期、初始部位彻底清除病原体对于动物机体的免疫十分重要。鼻黏膜免疫是一个安全有效、操作方便的免疫途径，郑冬梅[13]通过对La Sota弱毒苗免疫后雏鸡黏膜免疫系统中IgA的消长规律进行研究，证明了鼻黏膜免疫途径产生的IgA量均高于其他免疫途径途径，能有效地刺激鼻黏膜局部分泌特异性IgA、IgG，引起广泛的黏膜免疫反应，对清除病毒及细胞内及寄生物有很大的作用。

溶液的pH、壳聚糖浓度、MgSO4浓度、TPP浓度等都会影响到纳米颗粒的稳定性、粒径、包封率，从而影响纳米颗粒疫苗效果[14]。免疫实验中，纳米颗粒疫苗组具有较高的IgG、IgA水平。在攻毒保护试验中，DNA纳米颗粒疫苗点眼滴鼻组具有100%的保护率，具有良好的保护效果，结果表明该疫苗对新城疫的防治具有一定的应用价值。另外，本试验初步探讨新城疫新型疫苗的应用，为相关新城疫新疫苗的开发提供了一些新思路。