不同产区酱香型高温大曲黑、白、黄曲的理化、挥发性成分差异性分析

王颖，邱勇，王隆，肖扬，黄浩特，罗爱民

(四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065)

酱香型白酒，是用高温大曲作为糖化发酵剂经过固态发酵酿制而成[1]。高温大曲的原料是小麦，经粉碎后加水和曲母踩成曲坯，在室内保温培养使微生物生长繁殖，以产生酿酒中所需要的多种酶类风味成分，再经风干、储存，即成高温大曲[2-3]。由于发酵仓内位置、温度、水分的差异，使得大曲形成了3种不同颜色和风格的高温大曲：黑、白和黄曲，3种类型的大曲一般通过水分、颜色、气味等感官评估来区分[4-5]。成品大曲是由这3种大曲按照一定的比例混合而成。

大曲富含多种酶类，大曲中的微生物利用水解酶系将蛋白质、脂肪、淀粉和纤维素等原料分解成小分子物质，供微生物生长利用[6-7]。另外，有一些代谢产物是白酒中香味物质或者为香味物质提供前驱物质，这些代谢产物是酱香型白酒风格特征的来源[8]。从酱香型大曲中共确定了259种挥发性成分，其中酯类和醇类最多，其次包括吡嗪类、醛类、酮类、酸类、酚类、呋喃类、其他杂环类、内酯类、醚类、含硫类、芳香烃类、脂肪烃等[9]。目前，酱香型成品大曲的理化、代谢产物、微生物群落等报道很多，但对黑、白和黄曲的理化性质、挥发性成分特征研究较少。因此，本实验测定了两个产区3种大曲的理化指标和主要酶系，明确3种大曲的基本性质差异，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS)联用技术对两个酱香型产区的黄、黑、白曲中的挥发性风味成分进行检测，对挥发性成分进行初步鉴定，探讨3种大曲之间的成分差异，为高温大曲的制备提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

高温大曲：取自赤水河上游核心产区和赤水河中下游核心产区，分别命名为M和L，产区对应的高温黄曲、黑曲、白曲，分别编号为MY、MB、MW和LY、LB、LW。

1.2 试剂

盐酸、硫酸铜、氢氧化钠、次甲基蓝、酒石酸钾钠、乙酸锌、葡萄糖、亚铁氰化钾、冰乙酸、邻苯二甲酸氢钾、酚酞、无水乙酸钠、溴甲酚绿、甲基红、三氯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、福林试剂、干酪素、L-酪氨酸、乙酸钠、可溶性淀粉、DNS、碘、碘化钾、无水乙醇、己酸、硫酸和甲醛：均为国产分析纯；2-庚酮：色谱纯。

1.3 主要仪器与设备

DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；UV56紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；DSQ9000气质联用仪 Thermo Scientific公司。

1.4 试验方法

1.4.1 大曲理化指标测定

大曲的水分、酸度、还原糖、氨基酸态氮、酯化力、糖化力和液化力的测定参照行业标准《酿酒大曲通用分析方法》[10]。水分采用恒重法测量，数据以百分含量表示；酸度采用酸碱中和，以pH值指示终点的点位滴定法，测定大曲的酸度，以mmol/10 g为单位计；氨基酸态氮利用氨基酸的两性作用的原理来计算，单位为g/kg；酯化力是按每50 g大曲在35 ℃经过7 d催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克数为一个单位，符号为U，以mg/(50 g·7 d)为单位表示；糖化力在35 ℃、pH 4.6条件下，1 g大曲1 h转化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克数为一个单位，符号为U，单位是mg/(g·h)；液化力在35 ℃，pH 4.6条件下，1 g绝干曲l h能液化淀粉的克数为一个单位，符号为U，以g/(g·h)表示。

1.4.2 大曲水解酶测定

蛋白酶测定方法参照行业标准SB/T 10317-1999《蛋白酶活力测定法》[11]，一个单位蛋白酶活性(U)定义为在 40 ℃下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量。糖化酶测定方法采用DNS法[12]，一个单位的糖化酶活性(U)定义为在40 ℃，pH 4.6条件下每小时水解淀粉产生1 mg葡萄糖的酶量。

1.4.3 顶空固相微萃取气质联用技术分析代谢产物

分别取6种大曲样品2 g与10 μL 2-庚酮(10 mg/L)混合作为内标，置于20 mL固相微萃取仪采样瓶中，60 ℃水浴15 min，插入装有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex萃取头的手动进样器，在60 ℃顶空萃取30 min取出，并立即进样，进样口温度230 ℃，热解吸3 min。色谱柱：DB-Wax(60.0 m×0.25 mm，0.25 μm)。升温程序：初始温度为50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至145 ℃，然后以 15 ℃/min升至230 ℃，并保持5 min，氦气以 1 mL/min的恒定流速用作载气。质谱仪以电子碰撞模式操作，电子能量设置为70 eV，扫描范围为33～400 m/z。使用美国国家标准与技术研究所(National Institute of Standards and Technology，NIST)和Wiley数据库鉴定每种化合物。选择正负匹配度大于800的化合物。根据内标峰面积与挥发性物质峰面积的比值，计算出大曲挥发风味的相对浓度。

2 结果与分析

2.1 大曲的理化指标主要酶系

黑曲、白曲和黄曲按照一定比例混合形成成熟高温大曲，大曲作为糖化发酵剂包含多种酶类。高温大曲的水分、酸度、氨基酸态氮、液化力、酯化力、糖化力等是评价大曲质量好坏的常用理化指标。黑曲、白曲和黄曲的理化指标和主要酶系测定结果见表1。

表1 大曲理化指标与主要酶系测定结果Table 1 The determination results of physical and chemical indexes and main enzymes of koji

水分在制曲过程中与菌的生长和酶的生成密切相关，成品曲水分一般不高于13%，如果大曲水分过高，大曲容易二次发霉，使质量下降[13]；如果水分过低，很容易影响大曲中酶的活性和微生物的正常生长。实验测定的两产区的3种大曲中，水分都符合低于13%的标准，且黑曲水分含量都最低；此外，M产区大曲的水分普遍高于L产区大曲的水分，这可能与它们的地理环境差异有关。

大曲的酸度主要来源于生酸微生物降解蛋白质、脂肪、淀粉等物质和有机酸代谢产酸，是微生物综合作用的结果[14]。实验结果表明两个产区的大曲中黑曲、白曲和黄曲酸度大小皆为：黑曲>白曲>黄曲，其中L产区黑曲的酸度最高，达到3.75 mmol/10 g。

大曲中氨基酸态氮的含量与产酸微生物的代谢和蛋白酶活力有着紧要联系，它反映了大曲中蛋白酶的活力以及微生物的种类和数量。两个产区的3种大曲中的氨基酸态氮皆为黑曲最低，其中MB和LB分别为1.26，2.59 g/kg。M产区的3种大曲中，黄曲的氨基酸态氮水平最高，达到2.22 g/kg；L产区为白曲最高，达到3.55 g/kg。蛋白酶将蛋白质降解为小分子多肽和氨基酸，使得大曲的酸度升高，但实际上两个酒厂的白曲的蛋白酶活性较高，但酸度不高，说明生成的氨基酸参与了微生物的生长代谢反应，生成其他物质，如酯类物质。

酱香型大曲中富含淀粉、脂肪以及蛋白质等成分，大曲中的微生物能够利用这些原料降解成小分子进而代谢产酸，为白酒产酯生香提供前体物质，因此大曲中的蛋白酶、糖化酶等主要酶类的酶活力高低也影响了大曲的质量。两个产区3种大曲的中性蛋白酶活性都有白曲>黄曲>黑曲的趋势，M产区大曲的蛋白酶活性普遍高于L产区蛋白酶活性，其中 M产区和L产区白曲的中性蛋白酶活力分别为34.99 U/g和33.5 U/g，这对蛋白质的利用有着积极的作用，生成的大量氨基酸可以进一步合成氨以及参加美拉德反应，与柳习月报道的结果一致。两产区的3种大曲的糖化酶都呈现白曲>黄曲>黑曲的趋势，M产区和L产区白曲的糖化酶活力分别为1075.90 U/g和849.11 U/g，说明白曲有很强的糖化能力，能够更好地实现淀粉的降解转化。大曲中糖化酶、蛋白酶等活力高低以及产酸微生物与大曲酸度紧密相关，大曲中的产酸微生物代谢产酸会导致大曲酸度较高，酶活力高的大曲酸度会偏高，而实际上糖化酶、蛋白酶活力最高的MW和LW的酸度并不高，这说明生成的酸可能参与代谢反应成其他物质。

大曲的酯化力和糖化力是受工艺控制参数影响最大的两个指标，并且与产品风格密切相关[15]。两个产区的3种大曲的酯化力高低都有白曲>黄曲>黑曲的趋势。M产区和L产区白曲的酯化力分别是253.88，110.73 mg/(50 g·7 d)，说明白曲转化合成酯的能力更高，并且M产区3种大曲的酯化力均高于L产区的相对应的3种大曲，这可能与两个产区的地理位置差异有一定关系；两个产区的糖化力都呈现白曲>黄曲>黑曲的趋势。M产区和L产区白曲的糖化力分别是588.98 mg/(g·h)和408.00 mg/(g·h)；两个产区的3种大曲的液化力都很低，在测定的时候差异并不明显。

2.2 两产区3种大曲的挥发性成分分析

2.2.1 不同大曲挥发性成分组成

将所有物质分为吡嗪类、酸类、醛类、醇类、酮类、酯类六大类，根据化合物的浓度绘制热图，见图1。

图1 3种大曲挥发性成分组成热图Fig.1 Heat map of volatile compositions of three kinds of koji

由图1可知，酯类、醇类、酸类占主导地位。酯类中，主要是棕榈酸乙酯、己酸乙酯、油酸乙酯、油酸甲酯等高沸点酯，白曲的酯类浓度最高。油酸乙酯、己酸乙酯、棕榈酸乙酯是对白酒的香味有一定的贡献，但过量会引起酒体浑浊。

黄曲的醇类物质浓度比黑曲和黄曲更高，醇类成分中2,3-丁二醇、苯乙醇，苯甲醇的含量较高，苯甲醇具有茉莉花油、风信子的芳香味[16]；黄曲的酸类成分浓度略低于黑曲，酯类成分浓度低于白曲。白曲的酸类挥发性成分浓度相较于其他类别更高，酸类物质中乙酸、异戊酸含量较高，乙酸可通过酯化反应与醇进一步合成为酯如乙酸乙酯等，对白酒的特殊风味做出了巨大贡献[17-19]。黑曲的醛类成分浓度比白曲和黄曲的更高些，其中壬醛、苯乙醛的浓度最高，壬醛稀释时则呈现出玫瑰和柑橘样的香气；另外，黑曲的酸类成分也较高。

6个样本的吡嗪检测出三甲基吡嗪和四甲基吡嗪，这两种物质认为是酱香型白酒主要的酱香味成分[20]。此外，四甲基吡嗪是白酒中的健康因子以及主要功能性成分之一，赋予白酒有益健康的功能[21-22]。在两个产区的3种大曲中，都存在白曲的吡嗪浓度最高的现象，黄曲次之，黑曲最低，这与柳习月报道的结果一致。其中四甲基吡嗪浓度高于三甲基吡嗪。四甲基吡嗪的前体物质乙偶姻是提高四甲基吡嗪含量的重要方式之一[23-24]，白曲中乙偶姻的浓度是3种大曲中浓度最高，3种大曲的乙偶姻浓度与四甲基吡嗪浓度的趋势一致。样品大曲还检出很多其他微量物质，这些物质虽然浓度低，但对白酒的风味前体物质和白酒风味物质的形成也至关重要。

2.2.2 大曲挥发性成分多样性差异

图2 不同大曲挥发性成分多样性主坐标分析结果Fig.2 The principal coordinate analysis results of diversity of volatile components of different kinds of koji

6种大曲一共检测出48种挥发性成分，相同的挥发性成分有18种。两个产区的白曲挥发性成分最多，其中LW有37种，MW有38种；黑曲最少，其中LB有28种，MB有31种。

由图2可知，同一产区的3种大曲差异很大；不同产区的黑曲差异最大，白曲和黄曲差异较小。同产区的黄曲距离接近，说明虽然产区不同，但同种香型的高温黄曲在挥发性成分多样性上的差异远小于同一产区的黑、白、黄曲之间的差异；另外，不同产区的白曲距离也比较接近。此外，不同产区的黑曲距离很远，说明不同产区的黑曲在挥发性成分多样性上存在较大差异。

2.2.3 两产区的大曲挥发性成分类别差异

a.L产区与M产区的黑曲浓度

b.L产区与M产区的黄曲浓度

c.L产区与M产区的白曲浓度

d.L产区与M产区大曲挥发性成分类别主坐标分析结果

将挥发性成分分为吡嗪类、酸类、醛类、醇类、酮类、酯类六大类，计算各类的浓度，以类别为横坐标绘制柱状图，分别对比不同产区的3种大曲的差异(见图3中a，b，c)；对样品挥发性成分的醇类、酸类、醛酮类、酯类和吡嗪类进行主坐标分析(见图3中d)。

就黑曲而言，两产区的酯类、酮类和吡嗪类没有明显差距，而M产区的醛类浓度远高于L产区黑曲，醛类成分以苯乙醛为代表，L产区黑曲的酸类成分浓度是M产区的2倍，其中乙酸、异戊酸为主要酸类成分。就黄曲而言，两产区中L产区的吡嗪浓度稍高于M产区，M产区的酯类物质浓度比L产区更多一些，其余类别的成分两产区相近，无明显差异。就白曲而言，L产区的吡嗪浓度近似是M产区的2倍，且L产区白曲的吡嗪含量是3种大曲浓度最高。

由图3中d可知，不同产区的白曲距离最近，黑曲距离最远，说明不同产区的白曲的挥发性成分中不同类别物质的含量比较相似，黑曲在类别上没有明显的相关性。同一产区的3种大曲的距离较远，说明同一产区的3种大曲在类别上差异明显，可能是不同产区的制曲工艺不同以及3种大曲在制曲过程中发酵仓内位置、温度、水分的差异造成的。

3 结论

不同产区的同一大曲和同一产区的3种大曲在理化指标、主要酶系和挥发性成分上都有一定差异。理化性质表明，L产区的水分偏低，酸度较高，3种大曲的酸度都存在黑曲最高，黄曲最低的特征。对于不同产区同一大曲而言，M产区的中性蛋白酶活力、糖化酶活力比L产区的更高。白曲的中性蛋白酶和糖化酶活力最高，两个产区的糖化力和酯化力都呈现白曲>黄曲>黑曲的趋势。由于糖化力和酯化力受工艺参数影响最大，造成不同产区的3种大曲的糖化力和酯化力差异较大。挥发性成分结果表明，在大曲的挥发性成分多样性中，不同产区的黄曲、白曲的差异都并不明显，黑曲差异较大。在大曲的挥发性成分类别差异中，不同产区的黑曲和黄曲都有明显的差异，白曲的差异相对较小。白曲的四甲基吡嗪、乙偶姻含量比黑曲和黄曲高。通过对不同产区的黑、白、黄曲的差异性进行分析，有助于提高大曲的稳定性，为高温大曲的生产理论及工艺的制定提供理论依据，促进成品大曲的稳定生产，从而提升酒体的质量。