五灵胶囊HPLC指纹图谱研究*

苏永健 杜鑫 刘红娜 张小华 张仙娟

(1.清华德人西安幸福制药有限公司，陕西 西安 710043;2.陕西省创新生物技术研究院有限公司,陕西 西安 710075)

五灵胶囊由原第四军医大学西京医院研制，清华德人西安幸福制药有限公司独家生产。五灵胶囊由柴胡、灵芝、丹参、五味子4味药材制成。功能主治为疏肝健脾活血。用于慢性乙型肝炎肝郁脾虚挟瘀证，症见纳呆，腹胀嗳气、胁肋胀痛、疲乏无力等。本方中柴胡辛行苦泄、善条达肝气、疏肝解郁、理气止痛为君药；灵芝味甘性平，益气健脾、补中益脾，丹参活血化瘀、通经止痛，共为臣药；五味子酸甘性温、补气养阴、佐助灵芝益气补中、安定心神、防柴胡疏泄升散而耗气伤阴为佐药。现代医学研究证明五灵胶囊对脂肪肝，肝纤维化有特殊疗效[1]。

目前关于五灵胶囊质量控制研究的文献报道较少，主要以柴胡、灵芝、丹参、五味子中化学成分含量检测为主。据文献报道,柴胡主要成分为皂苷类、挥发油类、黄酮类、多糖类及甾醇类等，其主要药理作用为：解热、镇静、镇痛、镇咳、抗炎、抗病毒、保肝、调节免疫、抗肿瘤等[2-3]。灵芝主要成分为多糖类、三萜及甾醇类、核苷类、生物碱类、氨基酸类、脂肪酸类及微量元素类，其主要药理作用为：抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、保肝、中枢抑制、调节血脂等[4]。丹参主要成分为水溶性的丹酚酸类、脂溶性的丹参酮类及多糖类、黄酮类、甾体类、菲醌类等成分，其主要药理作用为：心肌保护、抗凝血及抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化(AS)、调血脂、降血压、改善脑损伤、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗纤维化等[5-10]。五味子主要含有木脂素类、多糖类、挥发油类、有机酸类等成分，其主要药理作用为：保护心血管、保护中枢神经、镇静催眠、抗氧化、保肝、降血糖、抑菌、抗炎、抗肿瘤等[11-13]。

与化学制剂相比，中医的整体观决定了需要对中药中多种成分进行综合评价，但中药及其制剂中化学成分的多样性、复杂性以及相互间的协同作用，导致用单一成分或几个成分很难准确、全面地表达中药的质量和疗效。指纹图谱技术是近年逐渐发展起来的一项质量控制技术，它具有信息量大，特征性强，能整体控制多种组分的特点[14-15]。本实验参照2020年版《中国药典》(一部)及相关文献[16-19]，建立了以柴胡、丹参、五味子中化学成分为主要指标的HPLC指纹图谱方法，通过对共有峰进行归属及确认来控制五灵胶囊的质量。

1 材料

1.1仪器 Agilent1260 infinityⅡ型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；AG285型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；

1.2试剂与试药 对照品：丹酚酸B(批号111562-201917，纯度96.6%)，丹参酮ⅡA(批号110766-202022，纯度98.9%)，柴胡皂苷a(批号110777-201912，纯度94.8%)，五味子醇甲(批号110857-201815，纯度99.7%)，五味子乙素(批号110765-201813，纯度99.1%)五味子甲素(批号110764-201915，纯度99.5%)均购于中国食品药品检定研究院；10批五灵胶囊为清华德人西安幸福制药有限公司生产(批号S1:200101,S2:200102,S3:200103,S4:200301,S5:200302,S6:200303,S7:200304,S8:200501,S9:200502,S10:200503)；乙腈、磷酸均为色谱纯，甲醇等其他试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相；乙腈(A)-0.1%磷酸(B)；梯度洗脱(0～15 min，80%～50%B；15～40 min，50%～30%B；40～60min，30%～0%B；60～80 min，0%～0%B;80～85 min,0%～80% B;85～90 min,80%～80% B);体积流量0.8 mL·min-1；检测波长：210 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2溶液制备

2.2.1混合对照品溶液配制 取丹酚酸B、丹参酮ⅡA、柴胡皂苷a、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇制成每1 mL分别含丹酚酸B 100 μg、丹参酮ⅡA20 μg、柴胡皂苷a 400 μg、五味子醇甲300 μg、五味子甲素500 μg、五味子乙素500 μg的混合对照品溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.2供试品溶液制备 取五灵胶囊内容物0.4 g,精密称定，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇约40 mL，超声(频率50 Hz,功率200 W)30 min，至室温后再加甲醇至刻度，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性样品溶液 参照五灵胶囊制法，分别制备缺柴胡、灵芝、丹参、五味子药材的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1精密度实验 用批号为200503样品,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6针，以五味子醇甲为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD<3%，相对保留时间RSD<1%，表明仪器精密度良好。

2.3.2稳定性实验 用批号为200503样品,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下于0、2、4、8、12、24 h进样，以五味子醇甲为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD<5%，相对保留时间RSD<2%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.3重复性实验 用批号为200503样品,按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，以五味子醇甲为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD<5%，相对保留时间RSD<2%，表明该方法重现性良好。

2.4指纹图谱建立

2.4.1共有峰标定 选取五味子醇甲峰为参照峰(S)，色谱图中各色谱峰保留时间与参照峰(S)保留时间的比值为相对保留时间，通过相对保留时间值标定共有峰，其中16个峰为10批样品共有，标定为共有峰，共有峰面积占总峰面积75%以上，结果见图1。

图1 10批五灵胶囊样品HPLC指纹图谱

2.4.2相似度评价 共有峰通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)分析，中位数法建立对照指纹图谱R，见图2。10批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度分别为0.998、0.999、0.998、0.998、0.997、0.995、0.999、0.982、0.997、0.986，均在0.980以上，具体结果见表1。

图2 对照指纹图谱

表1 相似度分析结果

2.4.3专属性考察 取4种阴性样品及批号为200503样品,按“2.2.2”项下方法制备成溶液，分别吸取4种阴性样品及样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，色谱图见图3。通过与阴性样对比可以得出，共有峰1、11、13、16归属丹参，共有峰2归属柴胡，共有峰3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15归属五味子。

S1:丹参阴性样 S2：五味子阴性样 S3：灵芝阴性样 S4：柴胡阴性样 S5：五灵胶囊图3 共有峰归属

2.4.4共有峰指认 分别用混合对照品溶液及样品溶液按“2.1”项色谱条件下进样，色谱图见图4，通过对照品峰对共有峰进行指认，1号峰为丹酚酸B，2号峰为柴胡皂苷a，3号峰为五味子醇甲，12号峰为五味子甲素，13号峰为丹参酮ⅡA，15号峰为五味子乙素。

1:丹酚酸B 2:柴胡皂苷a 3:五味子醇甲 12:五味子甲素 13:丹参酮ⅡA 15:五味子乙素图4 对照品及样品HPLC图谱

3 讨论

本实验用甲醇、乙腈分别对样品进行处理，结果发现甲醇处理样品后基线更稳定，峰数量较多，因此本实验采用甲醇处理样品。本实验采用回流提取法及超声提取法分别对样品进行处理，对比发现，两种处理方法差异不大，因此选用简单实用的超声提取作为提取方法。本实验对超声提取时间(10 min、20 min、30 min、40 min)进行了考察，结果发现30 min时峰面积最大，30 min后峰面积几乎无变化，因此选择30 min为样品提取时间。本实验用乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.25%磷酸分别做梯度考察，结果发现用乙腈-0.1%磷酸进行梯度洗脱，基线平稳，各峰分离度较好，因此采用乙腈-0.1%磷酸作为梯度洗脱流动相。本实验对样品溶液进行不同波长(210 nm、250 nm、270 nm、305 nm)检测，发现210 nm时峰数量最多，信息量最大，因此采用210 nm作为检测波长。本研究还对流速及柱温等进行了考察，最后选择最佳流速为0.8 mL·min-1；最佳柱温为30 ℃。

本方法的16个共有峰分别归属于柴胡、丹参、五味子3种药材中，较全面反映五灵胶囊中各种成分的分布和比例关系。灵芝主要成分为多糖、三萜及甾醇类化合物，三萜及甾醇类化合物种类复杂且含量较低，紫外光(200 nm～400 nm)范围内吸收很弱[20-21]，故本图谱未能体现五灵胶囊中灵芝的成分分布及比例关系，这些不足有待于今后采用别的方法对灵芝继续进行研究。本方法通过对五灵胶囊中柴胡、丹参、五味子3种药材中多种成分的对比与分析，相比直接测定制剂中几种化学成分的含量，具有操作简便，信息量大的优点，能较全面的控制五灵胶囊的质量。