基于网络药理学讨论白花蛇舌草治疗溃疡性结肠炎的作用机制*

于鲲鹏 于永铎

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110847)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性炎症疾病，病变多累及大肠黏膜与黏膜下层，该病病程长，治愈难，易复发，可癌变，发病年龄段多介于20～50岁。其病因尚未明确，主要包括环境，遗传，感染，免疫，心理等多种因素[1]。最常见临床表现为腹痛，腹泻伴粘液脓血并可见发热，消瘦，贫血等表现。临床上确诊UC不仅需要符合上述症状，还需要结肠镜的镜下结果来明确诊断[2]。若未能正确及时诊疗，可导致肠息肉，中毒性结肠扩张，结直肠癌等并发症，严重影响患者生活质量[3]。单纯西医治疗并不能令人满意。而中医治疗凭借其标本兼治，辨证论治的特点可与西医治疗形成良好的互补关系，能降低复发率，减轻患者负担。因此加强中药治疗UC的研究就显得尤为重要。

近年来我国中医药事业蓬勃发展，对中药展开更深入的研究是大势所趋。白花蛇舌草是治疗炎症性肠病及肠道癌变的常用中药。中药白花蛇舌草为茜草科耳草属植物，入胃、大肠、小肠经。具有清热解毒，消痈利尿，活血止痛之功效[4]。《潮州志·物产志》中记载：“茎叶榨汁饮服，治盲肠炎，又可治一切肠病。”可应用于阑尾炎，尿路感染，皮肤感染等疾病的治疗中。现代药理学研究表明白花蛇舌草能通过抗菌消炎，抗氧化，保护神经系统，抗癌等作用发挥疗效[5-7]。

网络药理学是大数据背景下以系统生物学为基础并融合现代计算机技术的新兴学科，可从生物网络层面，对药物与治疗对象间的联系进行系统、科学、可靠的分析，进而得到药物有效成分，对应靶点和通路间的网络关系[8]。由于网络药理学研究方法十分契合中药有效成分复杂且成分作用部位多样的特点，目前已被广泛应用于中药研究领域。目前白花蛇舌草治疗UC的机制研究相对较少，在一定程度上影响了中药进一步的推广与发展，因此本文利用成熟的网络药理学技术对其进行进一步研究。

1 对象与方法

1.1白花蛇舌草有效成分及靶点的筛选 使用中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP) 收集白花蛇舌草的化学成分及靶点，以口服利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug-likeness，DL)≥0.18为指标进行筛选排除。利用UniProt数据库将预测蛋白靶点转换为靶点名并校正为标准名称。

1.2UC相关靶点的筛选 以“Ulcerative colitis”为检索关键词，分别在CTD，Genecards，Disgenet数据库中搜索与UC相关的靶点。去除重复靶点，使用Uniprot进行靶点名称转换。

1.3白花蛇舌草作用UC的靶点网络构建 登录Venny 2.1网站分析，输入以上TCMSP数据库中得到的白花蛇舌草有效成分靶点与CTD，GeneCards，DisGeNET数据库反馈的UC预测靶点取交集，将得到的相同靶点导入STRING数据库中，设置物种为人“Homo sapiens”，导出共同靶点间的相互作用图。下载TSV格式导入Cytoscape中，使用cytoHubba插件，并根据degree值选出靠前的关键潜在靶点。

1.4药物与疾病相关靶点分析 应用Cluster Profiler R包对白花蛇舌草治疗UC作用靶点进行分析，将上述靶点的Gene Symbol转换为Entrez ID，用enrichGO、enrichKEGG函数分别进行GO注释和KEGG通路富集分析，并将结果可视化，用气泡图，弦图等进行展示。

2 研究结果

2.1白花蛇舌草活性成分的筛选 通过TCMSP平台输入白花蛇舌草筛选活性成分，以OB及DL为筛选条件，得出活性成分7个，包括β-谷甾醇(beta-sitosterol)，槲皮素(quercetin)，豆甾醇(Stigmasterol)，多孔甾醇(poriferasterol),2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌(2-methoxy-3-methyl-9,10-anthraquinone)，2,3-二甲氧基-6-甲基蒽醌(2,3-dimethoxy-6-methyanthraquinone)等有效成分，经去重后得到123个药物靶点，并通过uniprot进行标准化转换。

2.2UC靶点的查找 使用GeneCards，DisGeNET，CTD数据库对UC的靶点进行查询，经搜索去重后得到相关疾病靶点17017个。

2.3运用Venny 2.1 list1输入药物靶点，list2输入疾病靶点，取交集得到119个靶点。如图1。

图1 白花蛇舌草的预测靶点与疾病预测鞍点的Venn图

2.4交集蛋白靶点相作网络构建 利用String数据库获取交集蛋白靶点网络，结果包含118个节点、1105条边，平均自由度为18.7，平均局部聚类系数为0.549。下载TSV格式导入cytoscape，运用cytoHubba插件，根据degree值选出潜在的重要靶点并作图，前6位分别是IL-6,VEGFA,TP53,TNF,EDF,JUN。degree值分别为59,55,53,53,50,49。见图2、图3。

图2 白花蛇舌草治疗UC靶点的PPI网络

图3 预测的重要靶点

2.5“药物-有效成分-对应靶点”网络构建 将白花蛇舌草有效成分及对应靶点基因导入Cytoscape软件进行网络构建及可视化共有126个节点，包括1个药物节点，7个有效成分节点，118个靶点节点。共有236条边。见图4。

图4 药物-有效成分-对应靶点

2.6GO富集分析 包含生物学的三个方面:生物过程(Biological process，BP)、细胞组分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)。其中BP分析(图5)显示为网络基因图，CC分析(图6)及MF分析(图7)显示为气泡图。图6，图7中横坐标表示基因在其富集结果中的比率，纵坐标表示在CC，MF过程中基因显著性排名前20的结果名称。圆点大小表示富集数目，圆点颜色表示P-value值。越接近红色P-value值越小，富集显著性越高，越接近蓝色则反之。由此可见BP包括：细胞对药物的反应(Cellular response to drug)对营养水平的反应(response to nutrient levels)、活性氧代谢过程(reactive oxygen species metabolic process)等；CC包括：膜筏(membrane raft)，微膜区(membrane microdomain)，膜区(membrane region)等；MF涉及神经递质受体活性(neurotransmitter receptor activity)，G蛋白偶联胺受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)，丝氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)等。见图5，6，7。

图5 GO分析生物过程(SP)网络基因图

图6 GO分析细胞组分(CC)

图7 GO分析分子功能(MF)

2.7KEGG通路富集分析 对119个共同靶点进行通路富集分析，图8B中圆点大小表示富集数目，颜色表示P-value值大小，圆点间的距离代表KEGG通路中相互关系程度。可发现主要富集通路有糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、松弛素信号通路(Relaxin signaling pathway)，HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)，IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)，PI3K-Akt 信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)TNF信号通路(TNF signaling pathway)见图8，9。

图8 KEGG通路富集分析网络基因图

图9 KEGG通路富集分析通路关系网络

3 讨论

研究表明，UC发病率在我国乃至世界均呈逐年增高的趋势，其中老年人是发病率增长最快的群体[9-10]，因此越来越多的学者开始对UC展开深层次的研究。西医治疗UC的药物主要有柳氮磺胺吡啶水杨酸制剂，皮质类固醇类药物，严重者可用硫唑嘌呤、JAK抑制剂等[11-12]，此外已有学者开始研究相关的靶向治疗方法[13]。但其疗效不稳定，复发率较高，副作用大[14-15]，而中医药以其个体化对症治疗的原则可以在一定程度上弥补西医治疗的短板。UC多归属于中医理论中的“肠澼”“久痢”“脏毒”等范畴[16]，传统中医认为其病机为脾肾亏虚，湿热之邪气蕴结大肠，化热可形成痈毒，侵袭肠道，肠络受损，迫血外溢，形成肠痈，其临床表现与UC十分吻合[17]。《诸病源候论》中肠痈侯记载“大便脓血，似赤白下，而寮非者，是肠痈也。”文中描述的内容与UC腹泻伴粘液脓血的表现极为相似；《医略》中云：“论痢之证治之理，正与痈疡机相暗合。”这表明湿热痈毒是可能造成UC的重要病机之一。固本文以“以痈论治溃疡性结肠炎”为研究方向，希望为治疗UC提供新的用药思路。白花蛇舌草清热解毒，散结消肿，能治疗各种内外痈，尤善治肠痈，可用于湿热毒盛所导致的UC，以及后期发展而成的结直肠癌等严重病症[18]。

本研究通过对白花蛇舌草主要有效成分的作用靶点进行筛选，并与UC疾病靶点进行交集处理，构建白花蛇舌草与UC的“疾病-有效成分-靶点”图，并对靶点进行GO富集分析与KEGG通路分析。本研究显示，白花蛇舌草中的槲皮素，β-谷甾醇，豆甾醇，多孔甾醇等物质为治疗UC的有效成分。Dicarlo等[19]通过肠道类器官研究表明槲皮素可以有效抑制炎症反应中TNF-α and LCN-2 mRNA.的表达，同时抑制IL-17,IL-22等炎症基因诱导的多糖。除此之外，槲皮素还能降低肠上皮C/EBP-β转录因子的表达而发挥抗炎作用，改善UC症状;β-谷甾醇是一种植物甾醇，目前已较广地应用于医疗卫生领域中。实验证明，β-谷甾醇可通过调节白细胞的趋化性，增加血管密度通透性，抑制TNF-α,IL-6,和IL-1β表达而发挥其抗炎作用，此外UC病情的发展与肠道内菌群间的不良反应有关。β-谷甾醇能增加肠上皮细胞中的AMPs，从而抑制肠道内沙门氏菌的存活率，改善肠道环境，有利于UC患者治疗与恢复[20];目前UC被认为属于自身免疫性疾病的范畴，而豆甾醇作为一种天然存在于多种药用植物中的类固醇。其已被证明是具有巨大治疗潜力的免疫调节剂[21]。 这可能对UC的治疗提供一定的帮助。

通过构建白花蛇舌草PPI网络构图可发现，不同的活性成分除了对应不同靶点外还可对应相同的靶点，这说明白花蛇舌草有效成分能通过多靶点对UC治疗发挥立体的治疗作用。其重要潜在靶点有IL-6,VEGFA,TNF，TP53等。IL-6作为炎症细胞因子中的重要因子，能活化细胞膜表面的gp130，使相关酶活化后与STAT3蛋白结合，进而激活NK-κB信号通路来参与UC的炎症发展进程[22]。 血管生成过程作为肠道炎症发展中的重要一环，会影响肠道黏膜修复与重塑，导致肠内炎症反应的加剧。Mateescu等[23]认为肠道中VEGF和内皮素(CD105)与UC炎症加剧存在密切关系，并可作为辅助治疗的靶点;此外VEGF可能还参与了诱导UC发展为肠癌的过程。结直肠癌是UC发展到终末期的严重并发症。p53和p16基因是肿瘤发生中的主要基因，不但可参与细胞衰老凋亡的周期性调控，还与炎症发展有关，当这些基因发生突变则可促使肠道癌变的发生。经实验发现，在UC患者中p53，p16，VEDF的表达均为阳性并且可诱导促炎性TNF-α和IL-6的阳性表达进而加重UC病情及其癌变的可能性[24-25]。TNF-α是一种促炎症介质,能够促进炎症反应，并最终促使癌变的发生，为UC病情发展中的重要炎症因子[26]。目前临床中已经使用抗TNF-α药物以减少类固醇暴露和依赖性，从而对控制UC病情和提高患者生活质量有一定帮助[27]。以上结果表明白花蛇舌草的有效成分能可能通过这些重要靶点的表达，对UC的发展进程产生一定的影响。

GO富集分析中显示其共同靶点的细胞组分有细胞的膜筏，微膜区，膜区，涉及神经递质受体活性，G蛋白偶联胺受体活性，丝氨酸水解酶活性等分子功能，并通过细胞对药物的反应，对营养水平的反应，活性氧代谢过程等生物过程对UC治疗起到作用。以上分析证明白花蛇蛇舌草可通过不同的生物学过程发挥其不同的分子作用来治疗UC，为中药能通过多维立体的方式对疾病进行治疗提供了较为详细的理论依据。

通过在KEGG通路分析中得到的结果，我们主要对其靶点富集程度较高的通路进行讨论分析。细胞和组织处于缺氧环境下会导致细胞凋亡坏死，在UC发展过程中肠道内细胞会处于缺氧状态，缺氧环境会使肠道内细胞发生氧化应激反应，最终加重肠道粘膜损害。经研究结果表明，晚期糖基化终末产物AGEs是一种通过Maillard反应生成的具有高度异质性的活性物质，其能产生持续的氧化应激反应，导致相应的血管组织受损。其与AGEs受体(RAGE)结合并激活AGE-RAGE通路而损伤肠道粘膜，同时可激活NADPH氧化酶(Nox)和NF-κB，进一步加重体内氧化应激反应，最终对肠道的微小血管造成一定的破坏[28];HIF-1信号通路除了作为肿瘤相关信号通路外，也是改善缺氧状态的重要通路，能调控耐氧机制、炎症修复机制和部分炎症反应[29]。在HIF-1信号通路中HIF-1α免疫因子与细胞缺血缺氧环境相关，HIF-1α可诱导VEGF和EPO基因表达来促进血管和红细胞生成，同时抑制细胞的凋亡[30]，以此来参与UC的炎症调控过程。肠道炎症被认为是导致UC的重要治病因素，本研究表明众多炎症相关通路可参与UC的炎症过程。众所周知，PI3K/Akt信号通路可参与细胞增殖、分化、凋亡和自噬过程，对其作用研究主要集中在肿瘤调节上。但Chen等[31]研究发现其还可以通过调节下游效应分子NF-κB、Bad、caspase9、m-TOR等分子的活性来调控炎症反应，此外还可促进免疫细胞如T细胞的增殖分化而导致炎症反应的发生，进而加重UC的炎症发展[32-33];IL-17介导的信号通路是重要的炎症通路，其相关因子在UC炎症发展过程中有重要意义[34]。IL-17/STAT3信号通路与肠道黏膜炎症及UC的癌变过程密切相关，通过IL-17介导使STAT3磷酸化来参与UC的严重癌变结果大肠癌的发展过程[35];松弛素是一种肽类激素，能显著抑制纤维化过程中肌成纤维细胞的活性并调节炎症过程[36]。实验表明，激活松弛素信号通路能抑制NLRP3炎症体的活动，进而降低IL-1β活性;同时抑制NF-κB信号的传导，松弛素还能通过调控免疫细胞如肥大细胞脱颗粒来减少组胺，白三烯等促炎及过敏因子的表达，从而起到控制炎症的效果，发挥对于UC的治疗作用[37-38];TNF信号通路同样与炎症与和癌症发展进程有关。TNF-α是一种与炎症及粘膜水肿发生有关的细胞因子，此类炎症介质可削弱体内的抗肿瘤免疫能力;并可激活NF-κB活性最终导致肠内癌变的发生[39-40]。孙婕怡等[41]通过实验发现，经过治疗使UC病情好转后，患者体内TNF-α因子的含量有明显的下降趋势。这说明TNF-α与UC存在密切的关系。综上所述，通过对白花蛇舌草治疗 UC 的关键靶点及其相关信号通路进行预测，揭示了糖尿病并发症的AGE-RAGE、IL-17、HIF-1、PI3K-Akt、TNF等信号通路为白花蛇舌草治疗UC的潜在重要通路，可通过调控氧化应激反应，炎症反应过程及肌体细胞免疫过程等发挥其多靶点，多通路共同治疗UC的作用。

4 结论

综上所述，本文通过网络药理学技术得到白花蛇舌草治疗UC的有效化合物7个以及相应药物靶点123个，并与17017个疾病靶点相交得到119个共同靶点。经分析后得出白花蛇舌草中的有效成分可能通过糖尿病并发症的AGE-RAGE、IL-17、HIF-1、PI3K-Akt、Relaxin，TNF等信号通路调控重要基因IL-6,VEGFA,TP53,TNF,EDF,JUN等靶点基因的表达而发挥抗炎，抗氧化应激反应，调节免疫等作用来对UC进行治疗。本研究与现有机制研究相吻合，具有可信度，能证明预测的有效性，为今后进一步研究白花蛇舌草治疗UC提供一定的科学依据，旨在更好的服务于临床用药。当然本文仍有一定的不足之处，如本文未具体讨论白花蛇舌草在通路中的代谢产物；虽然为临床常用药物，但对于白花蛇舌草相关的药理机制研究相对较少，基于白虎蛇舌草对UC的基础研究参考样本也较少，使得部分成果研究还有待进一步加强等，其中复杂的作用机制过程仍有待于未来更加细致的研究。