青胶蒲公英化学成分鉴定及质谱裂解规律研究

孔佳琦，孟宪双，尚宇瀚，董益阳，马 强

(1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029；3.北京化工大学橡胶植物研究中心，北京 100029)

蒲公英属植物种类繁多[1]，目前研究鉴定过的种主要包括西洋蒲公英(Taraxacumofficinale)、蒙古蒲公英(Taraxacummongolicum)、朝鲜蒲公英(Taraxacumcoreanum)和青胶蒲公英(Taraxacumkok-saghyzRodin,TKS)，其中医学研究论文涉及的蒲公英种多为西洋蒲公英、蒙古蒲公英和朝鲜蒲公英。青胶蒲公英[2]是菊科蒲公英属多年生植物，原产于哈萨克斯坦、乌兹别克斯坦和中国西北地区，因其根部含有丰富的胶乳而得到广泛研究，是具有开发潜力的产胶植物[3]。在实际生产过程中，青胶蒲公英的根部主要用于提取天然橡胶，而其叶并未得到有效利用。目前，青胶蒲公英的叶与经提胶后的根均被当作废料处理，附加值较低。

由于中草药成分复杂，对其中真正起治疗作用的成分往往不够清晰，从中草药中发现新的化学成分是筛选候选药物的重要途径，因此，针对青胶蒲公英中化学成分的鉴定对于深入开发其药用价值具有重要意义。但由于中草药基质复杂，且某些成分含量较低，中草药化学成分的鉴定工作仍面临一定困难。目前，质谱因高选择性、高特异性及高灵敏度等特点，在中草药分析领域有着广泛应用[4-8]，尤其是超高效液相色谱与高分辨质谱的结合，将复杂基质组分高效分离后进行质谱分析，可获得高分辨和高灵敏度数据，特别适用于中草药中复杂成分的鉴定。

本研究拟采用超声/微波辅助萃取技术对青胶蒲公英的根和叶进行高效萃取后，利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UHPLC-Q/Orbitrap HRMS)的全扫描-数据依赖型二级质谱扫描模式进行数据采集。为较好兼顾弱极性化合物的检出，本实验采用大气压化学电离源(APCI)。数据经预处理后，与相关中药数据库、在线数据库等比对分析，同时对部分化合物的质谱裂解规律进行推导，以期为相关成分结构类似物的快速鉴定提供实验依据，对进一步挖掘青胶蒲公英的潜在药用价值提供有益参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

UltiMate 3000超高效液相色谱仪、Q Exactive四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪：美国Thermo Fisher Scientific公司产品，配有大气压化学电离源及Xcalibur 4.1数据处理系统；Milli-Q Integral 5超纯水系统：美国Merck Millipore公司产品；UWave-2000多功能微波合成萃取仪：上海新仪微波化学科技有限公司产品；平行蒸发仪：瑞士BUCHI Labortechnik AG公司产品；KQ-500DE型超声清洗机：昆山市超声仪器有限公司产品；AB204-S型分析天平(感量0.001 g)：瑞士Mettler Toledo公司产品。

1.2 主要材料与试剂

青胶蒲公英：由黑龙江青胶蒲公英种植基地提供，经中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室和国家植物基因研究中心(北京)鉴定为菊科蒲公英属青胶蒲公英(Taraxacumkok-saghyzRodin)的干燥根、叶；甲醇、乙腈(质谱级)：美国Thermo Fisher Scientific公司产品；甲酸(质谱级)：美国Sigma公司产品。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY BEH C18柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；柱温：35 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脱程序：0～2.0 min(5%B)，2.0～50.0 min(5%～100%B)，50.0～55.0 min(100%B)，55.0～55.1 min(100%～5%B)，55.1～60.0 min(5%B)；流速：0.5 mL/min；进样量：3 μL。

1.3.2质谱条件 大气压化学电离源；正、负离子化模式；离子源温度400 ℃；毛细管温度350 ℃；鞘气压力0.31 MPa；辅助气流速5 L/min；针电流5 μA；质量扫描范围m/z100～1 500；数据采集模式：全扫描-数据依赖型二级质谱扫描模式(Full MS/dd-MS2)采集；全扫描分辨率60 000；离子最大注入时间100 ms；碰撞模式：高能碰撞诱导解离(HCD)，碰撞能量20、40、60 eV，自动增益控制1×106。

1.4 供试品制备

将自然干燥的青胶蒲公英根和叶粉碎，过40目筛，准确称取1 g(精确至0.01 g)获得的根和叶粉末，置于不同的三口烧瓶中，分别加入20 mL甲醇，超声/微波辅助萃取20 min，其中微波功率400 W，超声功率560 W，温度50 ℃。将萃取液过滤蒸发，加入5 mL甲醇超声复溶，过0.22 μm有机微孔滤膜，取1 mL进行测定(n=3)。

1.5 数据处理

采用Thermo Fisher Scientific公司的Trace-Finder 4.1和Compound Discoverer 2.1软件处理质谱数据。将预处理后的数据与OTCML中药成分高分辨质谱数据库进行比对分析。根据3次平行实验均检出的化合物为初步确定检出物，将其进一步与在线数据库(如PubChem、ChemSpider等)比对相符，则为确定检出物。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

微波/超声复合萃取技术将超声波振动与开放式微波两种作用方式相结合，充分利用超声波振动的空穴作用及微波的高能作用，克服了微波辅助萃取时温度上升过快，易造成受热不均，从而萃取不完全的不足；同时也克服了超声萃取时间长及需外部加热等缺点，具有速度快、能耗低、溶剂用量少等优势，有利于极性和热不稳定性组分的萃取[9-11]。本实验中，青胶蒲公英的根和叶经干燥粉碎后，选择超声/微波辅助萃取，比较分析了甲醇、异丙醇、水、二氯甲烷、丙酮和乙腈等6种常见溶剂对青胶蒲公英的萃取效果，APCI+和APCI-模式下的总离子流图分别示于图1a，1b。二氯甲烷、丙酮和乙腈的萃取效果较差，信号响应强度较低；从色谱峰数量和丰度来看，APCI+模式下，水和异丙醇萃取物分别以极性和疏水性化合物为主，而在APCI-模式下，水和异丙醇萃取物色谱峰的信号强度整体低于甲醇。综合考虑萃取物色谱峰的数量、强度及分布，本实验选择甲醇作为萃取溶剂。

图1 不同溶剂萃取物在APCI+(a)和APCI-(b)模式下的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of the extracts using different solvents in APCI+ (a) and APCI- (b) modes

2.2 青胶蒲公英化学成分的鉴定

将UHPLC-Q/Orbitrap HRMS采集获得的原始数据，采用Compound Discoverer 2.1和TraceFinder 4.1软件进行色谱峰对齐和提取，对提取后的准分子离子及其同位素、碎片离子峰强度等信息进行OTCML检索匹配，依据匹配度分值(一般要求大于80分)对未知成分进行鉴定。为避免噪音等干扰因素，需预设峰提取规则，如质量偏差、信噪比及峰强度阈值等。依据空白溶剂甲醇和500 μg/L杜鹃花酸标准溶液的分析结果：峰面积>105及质量偏差<5×10-6。因此，为尽可能多地检出化合物并提高鉴定准确度，本实验将峰提取条件设置如下：质量偏差<5×10-6，信噪比(S/N)>10，峰面积>70 000，同时结合在线数据库及相关文献检索，进一步对未知物的鉴定进行验证。青胶蒲公英中杜鹃花酸依据一级精确质量数、同位素峰分布以及二级质谱图匹配的鉴定过程示于图2。采用OTCML检索以及参考在线数据库等，在青胶蒲公英根和叶中共鉴定了164种化合物，包括氨基酸类、香豆素类、苯丙酸类、黄酮类、生物碱类、倍半萜和萜类[12]等。

注：a.一级精确质量数；b.同位素峰分布；c.二级质谱图比对图2 杜鹃花酸的鉴定过程Fig.2 Identification process of azelaic acid

2.3 氨基酸及维生素的鉴定

青胶蒲公英根和叶中均鉴定出L-脯氨酸、L-缬氨酸和L-酪氨酸等多种氨基酸，且部分氨基酸在正、负电离模式下均出峰(如L-苏氨酸)。L-脯氨酸(C5H9NO2)在APCI+模式下的准分子离子[M+H]+为m/z116.070 61，其碎片离子为m/z70.065 13，与其脱羧后的碎片离子[M+H-COOH]+的m/z70.065 15一致。L-酪氨酸(C9H11NO3)在APCI+模式下的准分子离子[M+H]+为m/z182.081 17，可能有2种裂解途径：一是发生重排反应，生成m/z123.043 96碎片离子，与[M+H-C2OH-NH3]+的m/z一致；二是先丢失甲酸分子产生[M+H-HCOOH]+(m/z136.075 74)，随后丢失NH3生成[M+H-HCOOH-NH3]+(m/z119.049 11)，最终发生中性丢失(CO)得到m/z91.054 18。而在APCI-模式下，L-色氨酸的准分子离子峰[M-H]-为m/z203.082 58，可通过碎裂产生[M-H-COOH-NH2]-(m/z142.066 13)、[M-H-COOH-NH2-C2H2]-(m/z116.050 56)和[C2H4NO2]-(m/z74.024 76)等碎片离子。

在青胶蒲公英根和叶的甲醇提取物中鉴定到的维生素类包括烟酸、烟酰胺、维生素D2和维生素D3。以烟酸为例，其在APCI+模式下准分子离子峰[M+H]+为m/z124.039 20，碎片离子为脱羧生成的[M+H-CO2]+(m/z80.049 39)。

2.4 核苷类化合物的鉴定

在青胶蒲公英中鉴定出胞嘧啶、腺嘌呤、胞苷、腺苷、尿苷、鸟苷和巴豆苷等核苷类化合物。胞苷在APCI+模式下的准分子离子峰[M+H]+为m/z244.092 45，通过丢失1分子核糖可得到[M+H-C5H8O4]+(m/z112.050 41)，该碎片离子进一步丢失NH3可产生[M+H-C5H8O4-NH3]+(m/z95.023 72)碎片离子。鸟苷(C10H13N5O5)在APCI-模式下的准分子离子[M-H]-为m/z282.084 26，同样可通过脱掉1分子核糖产生[M-H-C5H8O4]-(m/z150.042 04)和[C5HN4O]+(m/z133.015 55)碎片离子。胞嘧啶在APCI+模式下的准分子离子峰[M+H]+为m/z112.050 40，在给予合适的能量后，丢失NH3生成[M+H-NH3]+碎片离子(m/z95.023 83)。腺嘌呤在APCI-模式下生成的准分子离子[M-H]-为m/z134.047 18，经碰撞诱导解离可获得[C4H2N3]-(m/z92.025 44)和[C4H3N4]-(m/z107.036 30)。综上所述，核苷类物质的质谱裂解规律主要是准分子离子脱去核糖，或进一步发生碎裂丢失NH3等生成其他碎片离子。

2.5 黄酮类化合物的鉴定

在青胶蒲公英中鉴定出9种黄酮类化合物，分属黄酮类、黄酮醇类、查尔酮类和异黄酮类。其中，木犀草素、羟基芫花素、5-羟基-6,7-二甲氧基黄酮和高车前素属于黄酮类，龙血素A归属为查尔酮类，非瑟酮和山奈酚属于黄酮醇类，而鸢尾甲黄素B和鸢尾黄素属于异黄酮类。同属一类的化合物母核相同，裂解规律相似，主要发生脱去CO、CO2、H2O等基团的反应及重排反应。例如，在APCI+模式下，龙血素A的准分子离子[M+H]+为m/z287.127 32，其碎片离子包括[M+H-CH3OH]+(m/z255.101 29)、[M+H-2CO]+(m/z227.106 45)和[C7H5O2]+(m/z121.064 67)，符合黄酮类的一般碎裂途径。而鸢尾甲黄素B在APCI+模式下的分子离子[M+H]+为m/z331.081 12，由于其分子结构中含甲基，裂解过程中可能通过丢失甲基产生[M+H-CH3]+(m/z316.054 40)，也可能通过其他裂解方式生成如[M+H-H2O]+(m/z313.034 48)、[M+H-OCH3-OH-C2H2]+(m/z259.205 60)、[C7H5O2]+(m/z121.101 20)等特征碎片离子[13]。

2.6 香豆素类化合物的鉴定

在青胶蒲公英中共鉴定出19种香豆素类化合物[14]，由于结构类似，它们在电离过程中的裂解行为也基本相同。在APCI-模式下，香豆素类化合物的裂解途径(以七叶苷为例)示于图3。香豆素母核上若存在取代基，则取代基在电离过程中易丢失。此外，还存在中性丢失，如失去CO、H2O和CO2，生成一系列m/z159、147、131、119、103、91等共同碎片离子。分别以异补骨脂素和8-甲氧基呋喃香豆素为例，异补骨脂素在APCI+模式下的准分子离子[M+H]+为m/z187.038 77，碎片离子包括m/z159.043 91、143.085 42、131.049 01，所得碎片离子信息符合香豆素类化合物的一般裂解规律，其中，m/z159.043 91、143.085 42和131.049 01分别为[M+H-CO]+、[M+H-CO2]+和[M+H-2CO]+碎片离子，可与文献[15]报道相互印证；8-甲氧基呋喃香豆素在APCI+下的准分子离子[M+H]+为m/z217.049 22，碎片离子包括[M+H-CH3]+(m/z202.076 49)、[M+H-2CO]+(m/z161.059 49)和[M+H-CO2-CO-OCH3]+(m/z115.054 07)，经鉴定同样符合上述香豆素类化合物的一般裂解规律。

图3 APCI-模式下七叶苷的质谱裂解途径Fig.3 Proposed fragmentation pathways of esculin in APCI- mode

2.7 萜类及甾醇类化合物的鉴定

青胶蒲公英中含有丰富的萜类化合物。本研究共鉴定出2种单萜化合物、1种二萜化合物、15种倍半萜类化合物和14种五环三萜类化合物。萜类化合物的质谱裂解方式主要发生中性丢失和Diels-Alder反应。樟脑属于单萜，在APCI+模式下形成的准分子离子[M+H]+为m/z153.127 52，进而通过裂解产生[M+H-H2O]+(m/z135.116 88)、[M+H-H2O-C2H4]+(m/z107.085 60)、[M+H-H2O-C3H4]+(m/z95.085 62)和[M+H-H2O-C3H6]+(m/z93.069 99)等碎片离子。二萜类化合物松香酸分子结构中含有3个六元环，当施加能量诱导解离时，六元环碎裂可产生[M+H-C6H14-CO2]+(m/z149.132 16)和[C9H13]+(m/z121.101 25)碎片离子。

从青胶蒲公英样品中鉴定出的倍半萜类化合物包含愈创木烷型倍半萜(去氢木香内酯、含笑内酯和姜黄醇等)、桉烷型倍半萜(青蒿酸、双青蒿酸、甘松新酮[16]和白术内酯Ⅲ等)和吉玛烷型倍半萜(姜黄酮、林丹内酯和小白菊内酯等)。其中，愈创木烷型倍半萜姜黄醇在APCI+模式下产生的准分子离子[M+H]+为m/z237.184 45，通过解离可获得[M+H-H2O]+碎片离子(m/z219.175 40)；吉玛烷型倍半萜小白菊内酯[17]的准分子离子[M+H]+为m/z249.147 93，通过在醚键处丢失1分子H2O可产生 [M+H-H2O]+碎片离子(m/z231.137 42)，进而发生中性丢失，得到[M+H-H2O-CO]+(m/z203.142 56)，或经过碰撞产生[C13H13O]+(m/z185.131 91)和[C8H9]+(m/z105.069 73)碎片离子；桉烷型倍半萜类化合物白术内酯Ⅲ在APCI+模式下产生的准分子离子[M+H]+为m/z249.148 27，其可能的裂解途径示于图4。青蒿素是一种倍半萜类化合物，以青蒿素[18]为例，探究此类倍半萜在APCI+模式下的离子化方式，其准分子离子[M+H]+为m/z283.153 53，可能的裂解途径示于图5。

图4 APCI+模式下白术内酯Ⅲ的质谱裂解途径Fig.4 Proposed fragmentation pathways of atractylenolide Ⅲ in APCI+ mode

图5 APCI+模式下青蒿素的质谱裂解途径Fig.5 Proposed fragmentation pathways of artemisinin in the APCI+ mode

五环三萜类化合物的常见类型包括齐墩果烷型、羽扇豆烷型和乌苏烷型，它们的分子结构类似，其六元环3号位的取代基一般为羟基、羰基或羧基，17号位的取代基一般为羟基或羧基，因此它们具有相似的碎裂模式。在APCI+下，五环三萜类化合物一般会脱去3号位或17号位上的取代基，然后并列六元环断裂产生一系列共同碎片离子(z=1)，如C30H49(m/z409)、C23H23(m/z299)、C23H21(m/z297)、C20H29(m/z269)、C18H27(m/z219)、C18H25(m/z217)、C15H23(m/z203)、C14H23(m/z191)、C14H21(m/z189)、C8H13(m/z109)、C8H11(m/z107)、C7H11(m/z95)和C6H9(m/z81)等[19]。对每类五环三萜类化合物选取1个代表化合物进行裂解规律的推导，其结果示于图6。

图6 APCI+模式下五环三萜类成分的质谱裂解途径Fig.6 Proposed fragmentation pathways of pentacyclic triterpenoids in APCI+ mode

此外，通过数据库比对可知，从青胶蒲公英样品中鉴定出的4种甾醇类化合物分别为豆甾醇、泽泻醇A、β-谷甾醇和菜油甾醇。甾醇类化合物与五环三萜类化合物类似，APCI+电离过程中首先在含—OH或者—COOH处加H生成[M+H]+准分子离子，随后可发生脱水反应，并进一步产生类似于五环三萜类化合物中六元环碎裂后生成的一系列碎片离子。例如，β-谷甾醇的准分子离子为[M+H]+(m/z415.392 88)，碎片离子为[M+H-H2O]+(m/z397.382 45)、[C12H15]+(m/z161.132 68)、[C11H15]+(m/z147.116 23)和[C9H11]+(m/z119.085 44)。

2.8 有机酸化合物的鉴定

有机酸多为碳环芳香族酸酚性化合物，这类化合物在植物中广泛存在，并具有一定的抗菌、抗炎、抗氧化等作用[20-21]。在青胶蒲公英根和叶样品中共鉴定出44种有机酸成分，其二级质谱的碎裂模式包括失去苯环取代基、脱羧、脱水和碳链碎裂等。以杜鹃花酸为例，推测非芳香酸可能的裂解途径，其结果示于图7。以新绿原酸[22]为例，推断碳环芳香族酸酚性化合物可能的裂解规律，其结果示于图8。

图7 APCI+模式下杜鹃花酸的质谱裂解途径Fig.7 Proposed fragmentation pathways of azelaic acid in APCI+ mode

图8 APCI-模式下新绿原酸的质谱裂解途径Fig.8 Proposed fragmentation pathways of neochlorogenic acid in APCI- mode

3 结论

本研究采用UHPLC-Q/Orbitrap HRMS技术，在APCI正、负电离模式下对青胶蒲公英根和叶中的未知化学成分进行鉴定，根据化合物的一级精确质量数、同位素峰分布及二级质谱碎片等关键信息，与中药数据库OTCML进行比对分析，并参考在线数据库及相关文献报道，共鉴定出164种化合物，包括黄酮类、香豆素类、萜类、有机酸类、生物碱类、木质素类等多种成分。此外，对部分鉴定化合物的质谱裂解规律进行推导，有助于新化合物的发现，同时为深入挖掘青胶蒲公英的潜在药用价值提供了理论基础。