霉菌毒素吸附剂-植物精油复合物和霉菌毒素吸附剂-有机酸复合物对蛋鸡盲肠菌群的影响

蔡玉琦， 张佳鑫， 陈继发

（宜春学院生命科学与资源环境学院，江西省高等学校硒农业工程技术研究中心，江西宜春336000）

肠道微生物能够参与宿主养分消化吸收，调节机体新陈代谢，维持机体免疫功能（Clavijo 等，2018；Horai 等，2017；Tremaroli 等，2012）。 微生物多样性降低或菌群结构失衡易导致宿主免疫机能下降、养分利用率降低、生长或生产性能下降（Wu等，2021；Zhang 等，2021）。 许多因素能够影响动物肠道菌群结构及微生物多样性。研究表明，多种霉菌毒素可降低动物肠道微生物多样性， 造成肠道菌群结构紊乱 （刘锦芳等，2019；Payros 等，2017；杨俊花等，2016）。过度繁殖的有害菌会打破肠道正常菌群的生态平衡， 降低肠道微生物多样性，破坏肠黏膜屏障功能（Xing 等，2021）。 当前，我国配合饲料普遍受到低剂量霉菌毒素[含量在我国《饲料卫生标准》（GB 13078—2017）限定范围内]污染（丁燕玲等，2021），同时动物饲料中已全面禁止添加促生长类抗生素。 因此，探寻安全、有效的饲料添加剂来调节动物肠道菌群， 改善肠道健康是实现蛋鸡高效生产的重要课题。目前，应用较为广泛的霉菌毒素脱毒方法是在饲料中添加霉菌毒素吸附剂（MA），蒙脱石等硅铝酸盐类MA能够吸附多种霉菌毒素， 有效干预霉菌毒素对动物健康造成的负面影响（Yang 等，2014；Wan 等，2013）。 植物精油（EO）和有机酸（OA）具有良好的防霉、抗菌、抑炎等作用，可调节家禽肠道菌群结构， 改善肠道健康（张嘉琦等，2021； 马嘉瑜等，2021；Hamid 等，2018）。 然而，应用单一饲料添加剂难以有效替代饲用抗生素及干预霉菌毒素的毒性。基于MA、OA 和EO 的功能，推测MA-OA 复合物和MA-EO 复合物也许能有效控制霉菌毒素、 有害菌等对蛋鸡的危害， 调节肠道菌群结构，提高微生物多样性，改善肠道健康。 另外，研究发现，添加MA-OA 复合物、MA-EO 复合物有提高蛋鸡产蛋率的趋势，显著提高了蛋重（陈继发和耿晓峰，2020）， 推测可能与二者调节蛋鸡肠道菌群有关。 因此，本试验在含有多种低浓度霉菌毒素饲粮中添加MA-OA 复合物和MA-EO复合物，研究其对蛋鸡盲肠微生物多样性、菌群结构及物种丰度的影响， 为二者在蛋鸡生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 MA-EO 复合物主要成分为：MA（蒙脱石）75%，EO （主要为丁香酚和肉桂醛）含量> 4%；MA-OA 复合物成主要分为：MA （蒙脱石）80%，OA（主要为甲酸、丙酸和丁酸）>10%。

1.2 试验设计与饲养管理 将270 只29 周龄的健康罗曼蛋鸡随机分为3 组，每组6 个重复，每个重复15 只。 对照组（CON 组）饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加0.70 g/kg MA-EO复合物 （MEO 组） 和0.65 g/kg MA-OA 复合物（MOA 组）的试验饲粮。 预试期1 周，正试期10周。 基础饲粮参照《鸡饲养标准》（NY/T 33-2004）设计， 其组成及营养水平见陈继发和耿晓峰（2020）文献。

蛋鸡采用3 层阶梯式笼养，每笼饲养3 只。试验1 ~ 10 周鸡舍平均温度、相对湿度分别为（26±3）℃、（77±6）%。 每日喂料2 次，自由饮水，光照时间为16 h/d。

1.3 样品采集 试验第70 天， 从各重复随机抽取1 只蛋鸡，参照曲湘勇等（2019）的方法采集蛋鸡盲肠内容物样品。

1.4 肠道微生物分析 提取蛋鸡盲肠内容物细菌DNA 后， 采用通用引物338F/806R 对细菌16S rRNA V4 区进行PCR 扩增，用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物， 用AxyPreP DNA Gel Extraction Kit 进行纯化，QuantusTMFlurometer 进行定量检测，使用NEXTFLEXRRepid DNA-Seq PE300平台测序。

1.5 数据处理与分析 盲肠微生物原始测序序列使用Trimmomatic 软件质控，Flash 软件拼接。对优化后的序列根据97%的相似度进行操作分类单元（OTU）聚类，对生成的OTU 信息进行细菌群落多样性和丰富度分析。 数据采用SAS 9.2软件进行Kruskal-Wallis 检验， 用Duncan 氏法进行多重比较，试验结果以“平均值±标准差”表示，P< 0.05 表示差异显著，0.05≤P< 0.10 表示有变化的趋势。

2 结果

2.1 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡盲肠菌群测序数据与α 多样性的影响 由表1可知，各组样品测序覆盖率均在99.6%以上，说明测序深度已基本覆盖到样品中的所有物种。 MOA组、MEO 组样品测序获得的有效序列和盲肠菌群Shannon 指 数、Ace 指 数、Chao 指 数 较CON 组 均有不同程度的提高（P> 0.05）。

表1 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡盲肠菌群测序数据与α 多样性的影响

2.2 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡盲肠菌群β 多样性的影响 如图1 所示，CON组、MEO 组菌群结构分布相对紧凑， 说明其物种相似度较高。 而MOA 组菌群结构分布相对分散，说明其物种相似度较低，群落构成差异较大。

图1 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡盲肠菌群β 多样性的影响

2.3 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡盲肠菌群物种丰度的影响

2.3.1 门水平 由表2 可知，在门水平上，各组中相对丰度大于1%的菌门有拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和梭杆菌门， 其中拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌门，占比达到90%左右。 各组间相对丰度大于0.15%的菌门相对丰度均无显著差异（P>0.05）。与CON 组相比，MOA 组、MEO 组绿湾菌门相对丰度显著降低（P< 0.05）。

表2 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡盲肠菌群门水平上相对丰度的影响

2.3.2 属水平 由表3 可知， 各组间蛋鸡盲肠优势菌属存在一定差异， 且以拟杆菌属相对丰度最高，其序列约占测序总量的32%。 CON 组相对丰度排前4 的菌属依次为拟杆菌属、 未明确瘤胃菌科、理研菌科RC9 群和考拉杆菌属；MOA 组相对丰度排前4 的菌属依次为拟杆菌属、 理研菌科RC9 群、考拉杆菌属和柔嫩梭菌属；而MEO 组相对丰度排前4 的菌属依次为拟杆菌属、 理研菌科RC9 群、考拉杆菌属和柔嫩梭菌属。 与CON 组相比，MEO 组、MOA 组理研菌属相对丰度有提高的趋势（P=0.099），肠球菌属相对丰度有降低的趋势（P=0.097），大肠志贺氏杆菌、梭杆菌属相对丰度有不同程度的降低（P> 0.05），乳酸杆菌属相对丰度有不同程度的提高 （P> 0.05）；MOA 组帕拉普氏菌属、 未明确厌氧绳菌科和未明确亚硝化单胞菌科相对丰度显著降低（P< 0.05），瘤胃梭菌属_1 相对丰度显著提高（P< 0.05），未明确克里斯滕森菌科、 不动杆菌属和丁酸球菌属相对丰度有提高的趋势（0.05≤P< 0.10），双歧杆菌属相对丰度有不同程度的提高（P> 0.05）。

表3 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡盲肠菌群属水平上相对丰度的影响

2.4 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡盲肠差异微生物的影响 通过LEfSe 分析属水平上具有显著差异的微生物 （图2）。 与CON 组相比，MOA 组乳酸杆菌属、瘤胃梭菌属_1、瘤胃菌科V9D2013 群、未明确克里斯滕森菌科和理研菌属等显著富集；MEO 组未明确消化球菌科和未分类厚壁菌门显著富集。与MEO 组相比，MOA 组臭气杆菌属、丁酸球菌属、瘤胃梭菌属_1、克里斯滕森菌科R_7 群、未明确克里斯滕森菌科和瘤胃菌科_UCG-014 等显著富集。

图2 差异微生物LEfSe 分析

3 讨论

3.1 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡盲肠菌群多样性的影响 肠道菌群多样性与菌群稳定性、机体新陈代谢及免疫防御能力等呈正相关（Butel，2014）。 本试验中，各组样品间α 多样性指数均无显著差异， 但MEO 组、MOA 组Ace 指数和Chao 指数较CON 组均有一定提高。 另外，经PCoA方法分析β 多样性发现，MOA 组菌群结构分布相对零散，相似度较低，提示样品中群落构成差异较大。 以上试验结果提示MA-OA 复合物和MA-EO复合物对蛋鸡盲肠菌群多样性的影响是正面的。研究发现，在含有多种低剂量霉菌毒素饲粮中添加蒙脱石对蛋鸡盲肠菌群α 多样性和β 多样性无显著影响（陈继发，2017）。容庭等（2018）研究表明，添加0.2%、0.3%酸化剂对肉鸡回肠菌群多样性没有产生显著影响。 Feng 等（2021）报道，饲粮中添加牛至精油对蛋鸡回肠菌群Chao1 指数、Shannon 指数和Simpson 指数均无显著影响，但在一定程度上提高了回肠菌群β 多样性。 以上研究结果与本试验结果基本一致。 研究证实，多种霉菌毒素对动物肠道菌群结构及微生物多样性会造成显著负面影响（Liu 等，2019；Payros 等，2017；Yang 等，2016）。 本试验蛋鸡饲粮被多种霉菌毒素污染，但毒素含量处于安全范围内（陈继发和耿晓峰，2020），其可能不会显著降低蛋鸡肠道微生物多样性， 进而添加MA-OA 复合物、MA-EO 复合物没有对蛋鸡肠道菌群多样性产生显著影响。

3.2 MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡盲肠菌群结构和物种丰度的影响 家禽肠道菌群主要由拟杆菌门和厚壁菌门组成（程浩等，2021；曲湘勇等，2019）。本试验中蛋鸡盲肠菌群拟杆菌门和厚壁菌门占比达到90%， 与前人的研究结果基本一致。 添加MA-EO 复合物和MA-OA 复合物对蛋鸡盲肠菌群优势菌门相对丰度没有产生显著影响，可能与健康成年蛋鸡肠道内已形成稳定的微生物区系有关。 在门水平上，MEO 组、MOA 组绿湾菌门相对丰度较CON 组显著降低。 绿湾菌门是一类通过光合作用产生能量的细菌， 是一种化能异养型细菌。 研究指出，绿湾菌门相对丰度与含水量呈负相关（康宝天等，2020）。本研究中，试验组绿湾菌门相对丰度显著降低，可能是由于饲料中添加了具有吸水性的蒙脱石。 另外， 本研究发现，MEO 组、MOA组梭杆菌门相对丰度较CON 组分别降低了43.71%、63.47%。Gao 等（2017）报道，结直肠癌患者肠道梭杆菌门相对丰度显著升高，提示此菌门丰度增加与肠道疾病有关。

在属水平上，MA-OA 复合物和MA-EO 复合物对蛋鸡盲肠菌群优势菌属相对丰度没有产生显著影响， 但在一定程度上优化了菌群结构。 MEO 组、MOA 组大肠志贺氏杆菌、梭杆菌属和肠球菌属相对丰度较CON 组均有一定降低。 大肠志贺氏杆菌是肠道致病菌，可诱发肠炎，释放细菌毒素，引起细菌及毒素“移位”。梭杆菌属包含坏死梭杆菌、溃疡梭杆菌和核梭杆菌等多种致病菌。苗慧芳等（2014）报道，与健康人相比，结直肠癌患者粪便中梭杆菌属相对丰度显著升高；Gao 等（2017）研究表明，梭杆菌属被鉴定为结直肠癌发生的关键因素，说明此菌属丰度提高与消化道疾病有关。 肠球菌属是革兰氏阳性菌中仅次于葡萄球菌属的重要医院感染病原菌，可引起尿路感染、腹部创伤和术后感染。

同时，经LEfSe 分析发现，添加MA-OA 复合物使蛋鸡盲肠乳酸杆菌属、未明确克里斯滕森菌科和理研菌属显著富集，且一定程度上提高了丁酸球菌属和双歧杆菌属相对丰度。乳酸杆菌属和双歧杆菌属是家禽肠道中有益菌群， 对宿主发挥营养、代谢和免疫等多重生理功能， 有利于维护宿主健康（Fukuda 等，2011）。 丁酸球菌属是肠道中优势的产丁酸菌，能发酵各种碳水化合物生成丁酸，丁酸可为肠上皮细胞生长提供能量（Fukuda 等，2011）。 据报道， 理研菌属是肠道内具有保护性功能的菌群，杨俊花等（2016）研究表明，脱氧雪腐镰刀菌烯醇显著降低了小鼠肠道理研菌属相对丰度。本试验蛋鸡饲粮中含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇等多种霉菌毒素（陈继发和耿晓峰，2020）， 提示添加MA-OA 复合物可能干预低浓度霉菌毒素对蛋鸡肠道菌群结构造成的负面影响。 克里斯滕森菌科属于厚壁菌门，其与炎症性肠病、 代谢综合征等显著负相关（Waters 等，2019）。另外，LEfSe 分析显示，与MEO 组相比，MOA 组丁酸球菌属、 克里斯滕森菌科R_7 群、未明确克里斯滕森菌科等显著富集， 提示添加MA-OA 复合物对提高有益菌属丰度的作用优于MA-EO 复合物， 可能与OA 能够降低肠道pH，抑制有害菌生长，促进有益菌增殖有关。综上所述，添加MA-EO 复合物和MA-OA 复合物在一定程度上降低了部分有害菌属相对丰度，MA-OA 复合物可促进部分有益菌属富集，说明其可调节蛋鸡盲肠菌群结构，这可能是二者在一定程度上提高蛋鸡生产性能（陈继发和耿晓峰，2020）的主要原因之一。

4 结论

饲粮添加0.65 g/kg MA-OA 复合物能够在一定程度上提高蛋鸡盲肠微生物多样性， 优化肠道菌群结构。