苹果贮藏室气体3D荧光特征信息小波包表征与腐败预警

于慧春 李 迎 殷 勇 袁云霞 李建盟

(河南科技大学食品与生物工程学院， 洛阳 471023)

0 引言

在苹果贮藏期间，实现对其腐败预警十分必要。目前，对果蔬贮藏中腐败变质过程的研究多采用感官评定[1]和理化指标检测[2]，这些方法主观性强或者处理过程繁琐。近年来，光谱检测技术被越来越多地用于果蔬品质检测，但是光谱检测需要随机检测大量的样本，且样本间具有个体差异性，检测结果无法真正体现贮藏室内苹果整体质量的变化。在果蔬贮藏过程中，贮藏室空气中浮游微生物及气体组成与果蔬品质变化密切相关。因此，通过对果蔬贮藏室气体的检测和分析，可以反映贮藏过程中果蔬的品质变化[3-5]。

3D荧光光谱技术因其高灵敏度、多组分选择性、荧光信息丰富等优点[6]，在环境、医药、食品等[7]领域得到广泛应用。因此，3D荧光光谱技术可用于分析苹果贮藏过程中的气体环境，并实现苹果贮藏过程中的腐败预警。要实现苹果的腐败预警，贮藏室空气荧光特征信息的有效表征是关键，但是常用的3D荧光光谱信息分析方法，如主成分分析[8-9]、平行因子分析[10-11]、交替三线性分解[12-13]等在荧光特征信息的提取过程中，需要结合被测对象具体品质指标，分别提取激发特征波长和发射特征波长，这不但计算过程较为复杂，而且存在一定局限：所提取的激发和发射特征波长会因被测对象品种变化而不同，缺乏适用性；品质指标仅是被测对象某一方面属性的表征，因此以品质指标作为指导提取荧光特征信息不能有效表征被测对象整体品质变化。

小波包(Wavelet packet)分解能同时获取信号的低频和高频分量[14]，在获取低频和高频信息的同时剔除冗余信息，既可以实现对荧光数据的压缩，提高数据分析的精度，降低计算的难度，又可全面提取被测对象的表征信息[15-16]。因此，本文提出一种基于小波包分解的3D荧光特征信息提取方法。该方法首先按激发波长顺序将其对应的发射光谱首尾相连展开成一维数据向量的形式，然后采用小波包对其进行分解，提取分解后的低频系数集作为荧光光谱特征向量。选用两批不同品种苹果贮藏室的气体作为研究对象进行研究，以检验研究方法的有效性。

1 数据获取

1.1 实验材料

第1批苹果，品种为山东烟台红富士，总质量350 kg，于2020年10月14日购于超市。常温贮藏，贮藏室温度波动范围为18～20℃，相对湿度波动范围为53%～65%。

第2批苹果，品种为山西红富士，总质量为350 kg，于2020年12月14日购于超市。常温贮藏，贮藏室温度波动范围为12～16℃，相对湿度波动范围为58%～65%。

两批苹果购买后即放入贮藏室，并开始每天对苹果贮藏室气体进行采集和3D荧光光谱检测。同时每天都对贮藏苹果的pH值、质量损失值、相对电导率、可溶性固形物(TSS)含量、可滴定酸(SA)含量和糖酸比6种生理生化指标[17]进行测试。由于在贮藏第20天左右，苹果表皮出现明显的深色褐斑，腐败现象明显，失去食用价值，因此测试过程在第20天结束。

1.2 检测方法

1.2.1贮藏室气体的采集与处理

将装有4 mL灭菌生理盐水(0.9 g/mL)的玻璃培养皿，放入HKM-Ⅱ型空气浮游微生物采样器(广东环凯微生物科技有限责任公司)中，设置空气采样器的采样量为1 000 L，采集10 min。为了保证采样的均匀性，将采样器放置在贮藏室中央位置。采样结束后，将样品收集定容于4 mL离心管中，TG16A型离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)转速10 000 r/min离心1 min后舍弃上清液，取剩余2 mL样液用振荡器混匀30 s后，进行3D荧光检测[3-5]。

1.2.23D荧光光谱检测

图1 紫外增强型三维荧光仪结构示意图Fig.1 Schematic of enhanced three dimensional fluorescence spectroscopy1.发射单色仪 2.CCD检测仪 3.样品池 4.激发单色仪 5.紫外增强氙灯 6.便携式计算机

3D荧光光谱采集仪器为实验室自行设计的紫外增强型光谱仪,如图1所示。激发光源为150 W紫外增强型连续氙灯，激发、发射带宽度均为5 nm,波长精度为±1 nm,信噪比大于800，积分时间为0.1～24 s，主要部件及参数如表1所示。实验采用3D荧光扫描模式采集数据，激发波长范围设置为300～400 nm，步长为5 nm，共21条激发波长，积分时间为1 s；发射波长范围设置为260～560 nm，步长为4 nm，共76条发射波长，积分时间为1 s。检测样本容器为2 mm×2 mm(底面长×底面宽)、容量0.7 mL的石英狭缝微量荧光比色皿。

表1 三维荧光光谱仪主要部件及参数Tab.1 Main parts and parameters of three dimensional fluorescence spectrometer

1.2.3苹果理化指标检测

(1)pH值

实验当天从贮藏室不同位置上随机选取3个苹果，将苹果去皮，取果实赤道部位果肉10 g，放入匀浆机，加入蒸馏水90 mL，每次匀浆时间60 s，然后用3层纱布过滤以去除浮沫及滤渣，用pH计(上海雷磁有限责任公司)进行测试。

每个苹果重复3次，共进行9个重复实验，取平均值。

(2)相对电导率

相对电导率可以体现果蔬组织细胞膜通透性的变化，可用以表征贮藏过程中果肉细胞的衰老程度。

实验当天从贮藏室不同位置上随机选取3个苹果，去皮，在果实赤道部位间隔均匀切取厚度为2 mm的1 cm×1 cm的果肉10块，放于锥形瓶中，加30 mL蒸馏水，用保鲜膜封口，25℃摇床中振荡30 min后取出，用滤纸吸干切片上水分，在锥形瓶中重新加入20 mL蒸馏水，静止30 min后，用 DDS-307型电导率仪(上海雷磁有限责任公司)测量此时电导率W1，将测量好的样本重新盖上薄膜密封，用电炉煮沸10 min，冷却至室温(20℃)，测量此时电导率W2。相对电导率W计算公式为

(1)

每个苹果重复3次，共进行9个重复实验，取平均值。

(3)可溶性固形物含量、可滴定酸含量以及糖酸比

糖酸比是评价果蔬风味的重要指标，也与其品质密切相关。实验当天从贮藏室不同位置上随机选取3个苹果，糖酸比计算公式为

(2)

式中SST——可溶性固形物质量分数

TA——可滴定酸质量分数

可溶性固形物含量用ATAGO N-8α型手持折光仪(上海人和仪器有限责任公司)测量，称取10 g果肉，研钵研磨后用2层纱布挤出滤液，取滤液，滴在手持折光仪上，读取数值，重复3次，取平均值。

可滴定酸含量利用酸碱中和滴定法测量。取10 g不同部位果肉，研钵中研至匀浆，后移至100 mL容量瓶中定容，摇匀。75～80℃水浴加热30 min后冷却至室温，2层纱布过滤取滤液。于锥形瓶中加入20 mL滤液、3～5滴0.5 mol/L的酚酞溶液，用0.1 mol/L的NaOH标准溶液进行滴定，当溶液初现粉色且30 s内不褪色即为滴定终点，记录所消耗的NaOH体积。重复3次，取平均值。可滴定酸质量分数计算公式为

(3)

式中C——氢氧化钠标准溶液浓度，取0.1 mol/L

V1——滴定时所消耗的氢氧化钠标准溶液体积，mL

V0——吸取滴定用的样液体积，mL

m——试样质量, g

(4)质量损失值

每天对贮藏室中不同位置上固定选出的6个苹果检测其质量，并求其平均值Ai，质量损失值A为Ai(i=1,2,…,20)与贮藏第1日质量A1的差值。

2 数据处理

2.1 数据预处理

检测到的3D荧光数据中除了包含有表征样品信息的荧光信号，还包含有瑞利散射、拉曼散射等干扰信息，会影响样品荧光信号，因此，首先用插值法消除瑞利散射，同时为进一步减少环境及噪声的影响，再对荧光光谱进行SG(Savitzky-Golay)卷积平滑处理[18-19]。

2.2 小波包变换

小波包变换(Wavelet packet transform)[20]既可以对低频部分信号进行分解，也可以对高频部分信号进行分解，将时频平面划分得更加细致，并能够根据被分析信号的特征，自适应地选择相似度高的频带，进一步提高时频与信号频的匹配度，从而提高信号的分析能力。这种分解既可以实现对荧光数据的压缩，提高数据分析的精度，降低计算的难度，又可全面提取被测对象的表征信息[21]。在小波包的变换函数中，sym小波函数具有较好的对称性和正交性，可减少分解时和重构时的相位失真。由于原始信号与小波基函数的相似性，小波系数即为小波基函数与原始信号相似的系数。因此，选用3层sym4小波包变换对荧光数据进行分解，用第3层的低频尺度分量系数集作为特征向量。

2.3 偏最小二乘

偏最小二乘(Partial least squares, PLS)[22]是一种结合了主成分分析、典型相关分析和线性回归分析的分析方法，可以同时实现回归建模、数据结构简化以及变量间的相关性分析，提取出反映整体信息的最有效的数据。

2.4 聚类分析

聚类分析(Spectral clustering)[22]又称层次聚类，是最常使用的聚类算法之一。以标准欧氏距离为分类依据，距离越小相关性越大，因此，根据苹果贮藏室空气荧光特征信息的聚类分析结果，来确定苹果的腐败基准，为贮藏过程中苹果的腐败预警模型构建奠定基础。

2.5 马氏距离

马氏距离(Mahalanobis distance, MD)[22]是一种常用的计算两个未知样本集相似度的方法[23-24]。样品间的马氏距离是由标准化数据和中心化数据计算出，不受量纲的影响，并且可以排除变量之间相关性的干扰。因此，可以通过计算不同贮藏日期空气荧光特征信息与腐败基准日空气荧光信息间的马氏距离，来判断贮藏期间苹果与腐败日苹果的近似度。马氏距离越小，说明贮藏苹果越接近腐败日苹果，由此实现苹果腐败的预警。马氏距离计算公式为

d2=(xi-y)S-1(xi-y)T

(4)

式中xi——第i个贮藏日的特征向量

y——腐败基准日的特征向量

S——腐败基准日的协方差矩阵

3 结果与分析

3.1 理化指标结果

两批苹果所测量的6个理化指标如表2、3所示。

从表2可以看出，第1批苹果随着贮藏时间的延长，苹果的pH值、可溶性固形物含量、相对电导率、糖酸比都呈现上升趋势，可滴定酸质量分数呈现下降趋势。从表3可以看出，第2批苹果在贮藏过程中，理化指标呈现一定的波动，但是pH值、相对电导率呈现上升趋势，与第1批苹果的相应指标一致；可溶性固形物含量呈现先升后降的趋势、可滴定酸质量分数呈现先降后升的趋势，糖酸比呈现先升后降的趋势。

表2 第1批苹果理化指标测试结果Tab.2 Physical and chemical data of the first batch of apples

表3 第2批苹果理化指标测试结果Tab.3 Physical and chemical data of the second batch of apples

3.2 预处理结果

在贮藏过程中，每天对苹果贮藏室空气进行采样和3D荧光检测，原始荧光光谱图如图2a所示，可以看出原始贮藏室空气的原始荧光信号存在较强的瑞利散射，掩盖了原始光谱中的有用信息。为获得较好的贮藏室空气3D荧光信号，采用插值法和SG卷积平滑对原始荧光光谱进行预处理，去除瑞利散射和噪声等环境因素的影响，预处理后的荧光光谱图如图2b所示，可以看出经过预处理后的荧光光谱图，样品峰更加突出，等高线图边际线更平滑，有利于进一步的数据分析。

图2 处理前后荧光光谱图Fig.2 Fluorescence spectra before and after treatment

3.3 特征向量提取结果

3D荧光光谱数据是由激发波长、发射波长、荧光强度构成的3D数据块，本研究中激发波长有(400-300)/5=21个，发射波长有(560-260)/4=76个，因此，共得到对应激发波长-发射波长位置上的荧光强度值有21×76=1 596个。

将每条激发波长下的发射波长展开，并按照激发波长顺序数将所有发射波长以接龙的形式连接，从而将原3D荧光光谱数据转化成1×1 596的一维荧光光谱数据向量[25]。

然后用Matlab 2004a 中wpdec(wave,3,‘sym4’)程序对荧光信号进行小波包分解，用wpcoe(t,)函数提取不同节点的小波包系数。由于贮藏果蔬品质的变化是一个较为缓慢的过程，小波包分解得到的低频系数集反映了样本的整体荧光信息，因此，提取分解后的低频系数集作为特征信息。经过小波包变换，从原始1 596个频点中提取了203个低频系数集来作为荧光特征信息。

3.4 腐败基准确定

将提取到的苹果贮藏室空气3D荧光特征信息进行PLS分析，结果如表4所示。对于第1批苹果的贮藏室气体荧光信息，当取其前3个因子作为聚类分析的输入时，获得最佳的聚类结果，如图3a所示；对于第2批苹果的贮藏室空气荧光信息，当提取其第2个和第3个因子作为聚类分析的输入时，获得最佳的聚类结果，如图3b所示。

表4 苹果因子累计贡献率Tab.4 Cumulative contribution rate of variance explained of apples %

如图3a所示，当类间距为1.8～2.0时(图中粗红线所在位置)，贮藏第1～16天相似度较高，归为一大类，贮藏第17～20天归为一大类(图中用每一个红框代表一类)。苹果在第17天品质发生了变化，因此，对于第1批苹果，确定贮藏的第17天为其腐败基准日，即以贮藏第17天时的贮藏室气体荧光信息来作为苹果的腐败基准信息。由图3b可知，当类间距为1.3～1.5时(图中粗红线所在位置)，同理，将贮藏第1～16天与贮藏第17～20天分成两类，贮藏第1～16天相似度较高，贮藏第17天没有与前16 d归为一类，苹果在第17天品质发生了变化(图中用每一个红框代表一类)。因此，对于第2批苹果，同样以贮藏第17天时的贮藏室气体荧光信息来作为其腐败基准信息。两批苹果虽然腐败基准相同，但是由于两批苹果的品种不同，两批苹果的类间距是不同的。

图3 苹果贮藏室空气样本聚类树形图Fig.3 Cluster tree diagram of air samples in apple storage room

3.5 预警模型构建

基于确定的腐败基准信息和荧光特征信息构建马氏距离预警模型。计算不同贮藏时间时，空气荧光小波包低频系数特征信息到腐败基准的马氏距离，结果如图4所示。

图4 马氏距离预警模型结果Fig.4 Mahalanobis distance warning model results

从图4中可以看出，对于两批不同品质的苹果，随着贮藏时间的延长，不同贮藏时间贮藏室空气的荧光特征信息与腐败基准日空气荧光信息间的马氏距离越来越小，即相似程度越来越高，苹果越接近腐败日苹果，马氏距离曲线整体呈下降趋势。对于两种苹果，基于空气荧光小波包低频系数特征信息构建马氏距离预警模型，检测结果显示两种苹果变化一致，说明该3D荧光特征信息提取方法的有效性。

第2批苹果在贮藏第12～14天温度降低，因此在图4b中显示出这几天马氏距离变化不明显。

4 结论

(1)提出一种基于小波包变换的3D荧光特征信息提取方法，基于所提取的荧光特征信息，构建马氏距离预警模型，并采用两种不同品种苹果进行了验证。针对两批不同品种苹果贮藏室内空气的3D荧光光谱，在去除瑞利和拉曼散射的基础上，将原始3D荧光光谱转化为一维荧光光谱后，进行小波包分解提取低频系数作为荧光特性信息。

(2)运用PLS对特征信息与6个理化指标进行分析，并对其分析结果进行聚类分析确定出腐败基准。最后构建马氏距离腐败预警模型。结果表明，基于小波包分解提取的荧光特征信息构建马氏距离腐败预警模型，实现了对贮藏期间苹果品质变化的腐败预警。

(3)该荧光特征提取方法对两种苹果都提取到了能有效表征其品质整体变化的特征信息，提取的特征信息具有较强的适用性，又避免了3D荧光光谱分析过程中对激发特征波长、发射特征波长的分别提取过程，使得过程更简单。因此，研究提出的小波包分解的低频系数作为荧光特征信息方法是有效的，所给出的预警方法也是可行的。另外，以贮藏室中气体为检测对象取代以苹果个体随机样本为检测对象，克服了苹果样本个体差异性的影响，使研究结果更加可靠、准确。