基于网络药理学及分子对接技术研究五苓散治疗前列腺增生的作用机制*

张凯波，李桓，王锁刚

1.兰考县中医院，河南 兰考 475300；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000

良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia，BPH)是由于前列腺移行区和尿道周围区域的上皮和纤维肌组织增生，导致前列腺良性增大[1]。本病常见于老年男性，随着老龄化社会的到来，BPH已成为严重影响老年男性生活质量的疾病之一[2]。BPH主要表现为前列腺体积增大、膀胱出口梗阻，出现以下尿路症状为主的临床症状[3-4]。目前治疗BPH多采用手术及药物治疗，如α受体阻滞剂、5α还原酶抑制剂等[5]，虽然能缓解症状，但性欲障碍、失眠等药物不良反应严重。

BPH属于中医学“癃闭”的范畴，早在《黄帝内经》中就有关于本病的论述，如《素问·宣明五气》就有“膀胱不利为癃”的相关记载。该病主要因膀胱气化不利，病位在肾和膀胱[5]。五苓散出自《伤寒杂病论》，是治疗太阳蓄水证的经典名方，由茯苓、猪苓、白术、桂枝和泽泻5味药组成，具有利水渗湿、温阳化气之功效[6]。临床研究发现五苓散能缩小增大的前列腺，明显改善BPH患者排尿功能[7-11]，但其具体作用机制不详，严重阻碍了该方的临床使用。

网络药理学可以整合多个数据库的资源，通过构建“药物-靶点-疾病”之间的网络关系，进而阐释药物作用靶点与疾病靶点关系，揭示中药有效成分的生物学作用，从微观层面到宏观层面揭示药物治疗疾病的机制，与中医学所阐述的整体理念一致[12-13]。本研究通过网络药理学及分子对接技术研究五苓散治疗BPH的作用机制，为五苓散治疗BPH的基础研究和临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 收集五苓散有效成分及其作用靶点在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)数据库(https：//tcmsp-e.com/)分别检索茯苓、猪苓、白术、桂枝和泽泻的化学成分信息。再通过生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug likeness，DL)≥0.18筛选出五苓散中所有药物的有效成分及有效成分作用靶点，并构建“中药-化合物-靶点”网络图。

1.2 BPH疾病靶点获取以“benign prostatic hyperplasia”为关键词，使用DrugBank(https：//www.drugbank.ca/)、GeneCards(http：//www.genecareds.org/)、OMIM(http：//www.omim.org/)以及TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)等与疾病相关的数据库中分别获取BPH的靶点，去重后即为疾病的相关靶点。

1.3 五苓散治疗BPH的靶点获取将五苓散有效成分的靶点与疾病的靶点进行韦恩(Veen)分析，取交集后获得共有基因，即为五苓散可能作用于BPH的相关靶点，并绘制中药-成分-靶点-疾病网络图。

1.4 五苓散治疗BPH的蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络的构建将1.3项下获得的靶点上传至STRING数据库(https：//www.string-db.org/)，设置种属为“Homo sapiens”，隐藏游离节点，进行PPI网络图的构建，运用Cytoscape 3.8.2对PPI网络图进一步分析和优化。

1.5 基因功能(gene ontology，GO)及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集运用R软件进行GO和KEGG通路富集分析，并通过气泡图将结果可视化，气泡越大，代表富集的基因数量越多；颜色越深，代表富集的显著性更强。

1.6 分子对接通过PDB(http：//www.rcsb.org/)、Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)网站和ChembioOffice、PyMOL、Autodocktools、Vina软件，运用分子对接技术验证关键靶点蛋白与化学有效成分的结合能力。

2 结果

2.1 五苓散有效成分收集、筛选及相关靶点获取结果通过1.1项下的数据库平台，经检索及条件筛选，根据OB≥30%和DL≥0.18，获得五苓散组方中的化学有效成分共计64个(桂枝7个，白术7个，猪苓11个，茯苓15个，泽泻10个)。再次利用TCMSP数据库中的靶点预测功能，经过数据筛选找到其对应的靶点蛋白，删除重复和无效值，得到64个五苓散药物作用靶点。将五苓散药物、药物有效成分及靶点导入至Cytoscape 3.8.2中，构建五苓散化学有效成分及预测靶点的关系网络图，如图1所示。

图1 中药—化合物—靶点网络图

2.2 疾病作用靶点获取结果通过1.2项下的疾病靶点数据库，综合各数据库所获靶点后去重，最终获取BPH的相关靶点3 951个。与五苓散的靶点进行匹配，构建“药物-疾病”靶点韦恩图，得到共有靶点46个，如图2所示。并构建“中药-化合物-靶点-疾病”网络图，见图3。

图2 药物预测靶点与疾病靶点的韦恩图

图3 中药-化合物-靶点-疾病网络图

2.3 蛋白相互作用网络构建结果运用String在线数据库，输入五苓散与BPH交集基因，获得PPI网络，将获得数据导入Cytoscape，将PPI网络图进行可视化(见图4)。该图由46个节点和200条边构成，其中节点大小、颜色深浅、连线疏密，代表靶点地位的重要性，分析得到度值前10位的核心基因：AR、ESR1、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3、HSP90AA1、RELA、CAT、NR3C1。

图4 PPI蛋白互作网络图

2.4 五苓散治疗BPH关键靶点GO生物学过程富集分析结果为获得关键靶点蛋白的生物作用，对交集靶点进行GO生物学功能富集分析，发现关键靶点在2 899个条目上富集，包括2 436个生物过程(biological process，BP)、174条细胞组分(cellular component，CC)和289条分子功能(molecular function，MF)。BP结果显示可能与类固醇激素反应、循环系统中的血管过程和应对雌二醇等生物学过程相关；CC的结果表现可能与膜筏、膜微区及膜区等密切相关；而MF结果表明可能与G蛋白偶联胺受体活性、乙酰胆碱受体的活动和核受体的活动等有关。图5展示了BP、CC和MF各前10位GO分析的结果。

图5 关键靶点GO富集分析

2.5 五苓散治疗BPH关键靶点的KEGG通路富集分析结果为获得关键靶点所富集的通路，对关键靶点进行KEGG通路分析，结果显示五苓散治疗BPH的关键靶点在211条通路上富集，其中包括雌激素信号通路、脂质和动脉粥样硬化、胆碱能突触、化学致癌-受体激活、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、钙信号通路等通路，图6为KEGG富集分析结果前20位的气泡图。其中，在PPI网络中位于核心基因的AR、ESR1、RELA、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3等涉及前20位的多条通路(图7)，表明AR、ESR1、RELA、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3可能为五苓散治疗BPH的关键靶点。

图6 KEGG 通路富集分析气泡图

图7 KEGG和弦图

2.6 活性成分与核心靶点的分子对接结果通过分子对接技术探讨五苓散的主要活性成分是否通过关键靶点AR、ESR1、RELA、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3、HSP90AA1、CAT和NR3C1发挥治疗BPH作用。从数据库中获取关键靶点的晶体结构，并下载PDB Formant格式文件，运用AutoDock4.2.6软件将化合物及靶点蛋白逐一进行分子对接(见表1)。由表2可知，五苓散所含的小分子化合物与关键靶蛋白对接能都小于-5.0 kcal·mol-1，说明结合较好。借助Pymol2.5.0软件对β-谷甾醇(MOL000358)与AR、ESR1进行分子对接可视化(图8)。

图8 分子对接模式图

3 讨论

BPH属于中医“癃闭”范畴，癃闭之名最早见于《黄帝内经》。《灵枢·五味》曾记载：“酸走筋，多食之，令人癃。”《素问·五常政大论》曰：“其病癃闭，邪伤肾也。”指出癃闭的病位在膀胱，认为其病机主要是膀胱和三焦的气化不利。《伤寒杂病论》提出用通阳化气方五苓散治疗癃闭。《伤寒论》和《金匮要略》指出该方原为治疗蓄水证，注重化气行水，气助水行，阳气宣通，正如叶天士曰：“通阳不在温，而在利小便[14]。”随着现代医学的发展，五苓散在中医临床辨证施治的理论指导下，临床应用更加广泛，不仅局限于肿胀利水等方面，在消化、血栓、关节炎、肾病及皮肤疾病等的治疗中亦有重要意义[15-19]，但其药方的开发与研究进展较慢，作用机制尚不明确。中医理论通过生物信息学工具，可以从多成分、多靶点角度揭示中药作用机制，对中医药未来的发展产生新的改变[12]。本研究在中医理论指导下，基于五苓散成分靶点和BPH靶点预测、药物-成分-靶点网络构建、Hub节点PPI网络构建、五苓散作用于BPH的核心靶点的GO富集分析和KEGG富集分析相结合的网络药理学方法，借助相关软件和数据库，从化合物分子角度进一步预测和阐明了五苓散治疗BPH的作用机制。

通过在TCMSP平台收集五苓散的5味中药，得到hederagenin、Cerevisterol、ergosta-7，22E-dien-3beta-ol、ent-Epicatechin、beta-sitosterol、(+)-catechin、taxifolin、sitosterol、Alisol B monoacetate、1-Monolinolein、ergosta-7，22-diene-3β-ol、ergosta-5，7，22-trien-3-ol等46个主要成分[6]，其中17个主要成分对应46个疾病靶点，网络拓扑分析获得五苓散治疗BPH的10个核心靶点，包括ESR1、RELA、AR、CAT、NR3C1、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3等，为了更加明确五苓散治疗BPH的生物学过程、细胞功能和分子组成，对10个核心靶点进行GO分析，这些靶点主要涉及类固醇激素反应、循环系统中的血管过程和应对雌二醇等生物学过程、膜筏、膜微区及膜区、G蛋白偶联胺受体活性、乙酰胆碱受体的活动和核受体的活动等生物过程。细胞组分方面，主要集中在G蛋白偶联胺受体活性、乙酰胆碱受体和核受体的活动等生物过程中。KEGG通路富集分析发现核心靶点对应的相关通路包括脂质和动脉粥样硬化、胆碱能突触、化学致癌-受体激活、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、钙信号通路、雌激素信号通路、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、凋亡-多种物种、弓形体病、含血清素的神经突触、甲状腺激素信号通路、神经退行性变的途径-多种疾病、结肠直肠癌、细胞凋亡、麻疹、刺激神经组织的交互、EB病毒感染等信号通路。为了验证网络药理学的推测，本研究选取五苓散的关键药效物质进行分子对接，对接结果显示，所有对接结合能均小于-5.0 k·mol-1。表明雄激素受体(androgen receptor，AR)、雌激素受体(estrogen receptor，ESR1)均与beta-sitosterol(β-谷甾醇)对接较好，由此可见五苓散的关键药效物质与BPH核心靶点蛋白能够稳定结合，验证了网络药理学关于五苓散作用机制的预测。

BPH发病机制复杂，关于激素诱导、老年发病、上皮-间质转化理论以及炎症/生长因子发病等理论较多[20]。研究发现，β-谷甾醇对增生的前列腺组织在病理形态上具有一定的改善作用，并且对丙酸睾酮所致的BPH模型小鼠具有一定的治疗作用[21-23]。ESR1、AR与BPH密切相关[24-26]。睾酮是男性体内重要的雄激素，可与AR结合从而具有生物活性，可以调节前列腺上皮细胞和基质细胞的增殖与分化[27]。Asiedu等[28]通过收集健康对照组和BPH患者血液样本，检测后发现BPH患者的血液样本中雄甾烷二醇、雄烯二酮以及游离睾酮的含量均较正常男性显著降低，但双氢睾酮的含量却显著增加。其机制可能是在5α-还原酶作用下，雄激素转化为双氢睾酮，在芳香化酶的作用下转化为雌二醇，导致前列腺上皮和基质细胞增殖、分裂，促进BPH的发病[29]。研究发现，雌激素也参与调节男性的生殖系统，男性睾丸产生大约30%雌激素，雌激素在睾丸的间质和上皮细胞中发挥重要作用，可见雄激素/雌激素二者的平衡对男性BPH的发生发展至关重要[30]。Chen等[31]也发现ESR1在BPH患者的前列腺组织中呈区域依赖性表达，雌激素能促进前列腺的基质细胞增殖。

综上所述，本研究发现五苓散中有效成分可能作用于BPH的关键靶点ESR1和AR，通过升高雌激素水平，降低前列腺和血清中睾酮和双氢睾酮浓度，调节雌激素/雄激素的平衡，抑制前列腺中上皮和基质细胞生长、增殖，从而治疗BPH[23，32-33]。但由于网络药理学自身的局限性，未来将采取基础研究的方法进一步探讨五苓散治疗BPH的作用机制，为五苓散治疗BPH提供更客观的证据。