不同省份小果沙棘叶中黄酮类化合物含量测定及体外抗氧化能力评价

高国燕，蒋林树，年 芳，王 慧*

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070；2.北京农学院动物科学技术学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206）

沙 棘（Hippophae RhamnoidesL.，Sea Buckthorn）又名醋柳、黑刺、酸刺，是胡颓子科沙棘属落叶灌木，主要多分布于我国西北、华北、西南等干旱地区，是一种药食同源植物，富含蛋白质、维生素、氨基酸、糖类、类胡萝卜素、甾醇、挥发油、黄酮、多酚、有机酸及微量元素等多种营养成分和功能活性成分（宁志雪等，2021）。据报道，沙棘中的主要功效活性成分为黄酮类化合物，由异鼠李素、山奈酚、槲皮素、芦丁等苷元构成，黄酮类化合物具有较强的抗病毒、抗氧化、增强机体免疫力等功能。活性氧自由基过量会造成机体脂质、蛋白质、DNA 等生物大分子的损伤，同时ROS 作为信号分子参与多种信号通路的转导，引发细胞分化、细胞凋亡、炎症或免疫反应等（卢德勋，2021）。而黄酮类化合物能清除机体生理和非生理自由基，发挥抗氧化作用（De Oliveira 等，2020）。

因采摘时间、采集部位、产地及品种的不同，沙棘的主要活性成分及抗氧化能力也存在一定的差异（杨岚等，2018 ；Ma 等，2016）。因此，本试验对我国不同省份种植的野生型小果沙棘叶片中的黄酮含量及抗氧化能力进行测定和评价，旨在为沙棘黄酮在缓解畜禽氧化应激中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究所用的沙棘叶于2019 年6 月分别采自新疆清河县（编号：XJ）、内蒙蛮汗山（编号：NM）、甘肃定西（编号：GS）、山西交城县（编号：SX）、辽宁建平（编号：LN）。

1.2 试验方法

1.2.1 沙棘叶中黄酮粗提物的制备和总黄酮含量测定 将小果沙棘叶片除杂干燥后粉碎，过40 目筛。石油醚脱脂后的沙棘粉末以1 ：35 g/mL 的比例各加入70% 乙醇溶液进行超声提取，每个样品超声3 次，每次超声为30 min。经冷冻干燥后获得小果沙棘叶总黄酮粗提物粉末。黄酮含量按照NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法测定（潘予琮，2021）。芦丁标准曲线的线性回归方程为：y=6.2758x+0.0387，R2=0.9995。

1.2.2 小果沙棘叶总黄酮中4 种黄酮类化合物的含量测定 槲皮素、芦丁、山奈酚、异鼠李素标准品及小果沙棘叶总黄酮粗提物粉末用甲醇溶解，0.22 μm 滤膜过滤备用。采用安捷伦1260型液相色谱仪用于高效液相色谱分析。色谱柱为Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流 动相选择乙腈（A）-0.5 % 磷酸溶液（B）；梯度洗脱（0 ～15 min，15% ～20% B；15 ～20 min，20% ～20% B ；20 ～55min，20% ～35% B ；55 ～60 min，35% ～85% B ；60 ～90 min，85%B）；流速1.0 mL/min ；检测波长350 nm；柱温25℃；进样量10 μL。

1.2.3 小果沙棘叶总黄酮抗氧化能力测定

1.2.3.1 小果沙棘叶总黄酮对DPPH• 清除能力

参考孙朦等（2018）方法，准确吸取不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的小果沙棘叶总黄酮溶液各2.0 mL，加入等体积的0.2 mmol/L的DPPH• 溶液，充分振荡混匀后避光放置30 min，在517 nm 处测定吸光度值，每个样品进行3 次重复。VC作阳性对照。

式中：A0 为2 mL DPPH 溶液和2 mL 无水乙醇的吸光度值；A1 为 2mL 样品溶液和2 mL无水乙醇的吸光度值；A2 为2 mL DPPH 溶液和2 mL 样品溶液的吸光度值。

1.2.3.2 小果沙棘叶总黄酮对ABTS＋•清除能力测定 参考付晓丹等（2015）方法，将7.4 mmol/L ABTS＋• 溶液与2.45 mmol/L K2S2O8溶液等比例混合，室温避光放置14 h 即得ABTS＋• 储备溶液。将ABTS＋• 储 备 溶 液 用pH=4.5 的NaAc-HAC 缓冲液稀释，使其OD734在0.7±0.02 时即为适宜的ABTS＋• 工作液浓度。在试管中依次加入总黄酮溶液0.2 mL、ABTS＋• 工作液0.3 mL，40% 乙醇溶液0.5 mL，充分振荡混匀后避光放置10 min，在734 nm 处测定吸光度值。以无水乙醇代替样品溶液为空白组吸光度值。

式中：A1 为样品测定吸光度值；A0 为空白对照吸光度值。

1.2.3.3 小果沙棘叶总黄酮对O2-•清除能力测定参考Wang 等（2018）方法，在试管中依次加入pH 8.2 的0.05 mol/L 的Tris-HCl 缓冲液4.5 mL、总黄酮溶液0.1 mL，混匀置于25℃水浴锅中预热20 min，后加入25℃提前预热的3 mmol/L 邻苯三酚溶液0.3 mL，混匀后于25℃水浴锅中反应5 min，加 入2 滴8 mol/L HCl 终 止 反 应，在320 nm 处测定吸光度值；以蒸馏水取代黄酮溶液为空白对照组；以蒸馏水取代邻苯三酚为样品溶液的本地吸光度值。VC作为阳性对照。

参考Wang 等（2018）的方法改进，在试管中依次加入pH 8.2 的0.05 mol/L 的Tris-HCl 缓冲液4.5 mL，置于25 ℃水浴锅中预热20 min，后加入总黄酮溶液0.1 mL 和25 ℃提前预热的3 mmol/L 的邻苯三酚溶液0.3 mL，混匀后于25℃水浴锅中反应5 min，加入2 滴8 mol/L HCl 终止反应，在320 nm 处测定吸光度值；以蒸馏水取代黄酮溶液为空白对照组；以蒸馏水取代邻苯三酚为样品溶液的本地吸光度值。VC作为阳性对照。

式中：A2为样品溶液的吸光度；A1为样品溶液的本底吸光度；A0为空白对照吸光度。

1.2.3.4 小果沙棘叶总黄酮还原能力的测定 参考陈红梅等（2016）方法，在试管中依次加入总黄酮溶液、pH 6.6 磷酸盐缓冲溶液和1% 的铁氰化钾溶液各1.5 mL，摇匀后于50℃水浴20 min，取出冷却后加入10% 三氯乙酸溶液1 mL，振荡均匀，4000 r/min 离心15 min。取上清液1 mL，加蒸馏水2 mL 和0.1% FeCl3溶液1 mL，混匀静置5 min，在700 nm 波长下测定吸光度值。以蒸馏水代替不同浓度小果沙棘叶总黄酮为空白对照组。

还原力吸光度值OD700= 样品吸光度值OD700- 空白对照吸光度值OD700。

1.3 数据处理 试验数据采用WPS Office Excel初步统计、作图，采用SPSS 20.0 进行Pearson’s相关性分析。

2 结果

2.1 不同省份小果沙棘叶总黄酮和4 种黄酮类化合物含量测定 5 个省份小果沙棘叶片中总黄酮含量为1.23% ～4.68%，依次为甘肃GS（4.68%）、山西SX（3.54%）、内蒙NM（2.85%）、新疆XJ（1.94%）、辽宁LN（1.23%）。由图1 可知，不同省份小果沙棘叶的4 种黄酮类化合物中，异鼠李素和槲皮素在5 省份小果沙棘叶中所占比例均相对较高；山奈酚所占比例相对较低；芦丁在新疆XJ 和辽宁LN 小果沙棘叶中所占比例较高。

图1 不同省份小果沙棘叶中4 种黄酮类化合物含量占比

2.2 不同省份小果沙棘叶总黄酮抗氧化能力测定

2.2.1 不同省份小果沙棘叶总黄酮对DPPH•清除能力 由图2 可知，在测定浓度范围内（0.1 ～1 mg/mL），5 个省份小果沙棘叶总黄酮对DPPH• 的清除率呈现一定的剂量关系，且清除率随黄酮浓度的增加而逐渐升高。总体看，5 个省份小果沙棘叶总黄酮对DPPH• 清除率高低依次为甘肃GS ＞山西SX ＞内蒙NM ＞新疆XJ ＞辽宁LN。

图2 不同省份小果沙棘叶总黄酮对DPPH•的清除能力

2.2.2 不同省份小果沙棘叶总黄酮对ABTS+• 清除率 由图3 可知，5 个省份小果沙棘叶中总黄酮对ABTS+•的清除率随添加浓度的增加而升高，表明其清除能力与添加浓度遵循量- 效应关系。当黄酮浓度为1 mg/mL 时，5 个省份小果沙棘叶中总黄酮对ABTS+• 清除率值为30.8% ～46.5%，清除效率最高的是内蒙NM 小果沙棘叶总黄酮（46.5%），清除效率最低的是甘肃GS 小果沙棘叶总黄酮（30.8%），此浓度下VC对ABTS+• 清除率为41.1%。

图3 不同省份小果沙棘叶总黄酮对ABTS+•的清除能力

图4 不同省份小果沙棘叶总黄酮对O2-•的清除能力

2.2.4 不同省份小果沙棘叶总黄酮还原能力 由图5 可知，在测定浓度范围内（0.1 ～1 mg/mL），5个省份小果沙棘叶中总黄酮还原力均不如VC，但随着小果沙棘叶总黄酮质量浓度的升高，吸光度值逐渐增大，表明抗氧化能力逐步增强。当浓度为0.1 ～0.6 mg/mL 时，甘肃GS 小果沙棘叶总黄酮还原力从0.084 提高到0.762，其在1 mg/mL 时的还原力可达到同等浓度VC还原力的76.9%，表现出较好的抗氧化能力。

图5 不同省份小果沙棘叶总黄酮还原能力

2.4 不同省份小果沙棘叶总黄酮抗氧化力的IC50（EC50）值 由表1 可知，不同省份小果沙棘叶总黄酮和阳性对照VC对DPPH• 清除力的IC50值大小依次为VC＜GS ＜SX ＜NM ＜XJ ＜LN；ABTS+• 清 除 力 的IC50值 大 小 依 次 为VC＜SX＜GS ＜LN ＜NM ＜XJ；O2-• 清除力的IC50值大小依次为SX ＜XJ ＜NM ＜VC＜LN ＜GS ；还原力的EC50值大小依次为VC＜GS ＜SX ＜NM＜XJ ＜LN。综合分析可知，山西SX 和甘肃GS较其他小果沙棘叶总黄酮抗氧化能力强。

表1 不同省份小果沙棘叶总黄酮抗氧化力的IC50（还原力，EC50）值 mg/mL

2.5 小果沙棘叶各黄酮含量与抗氧化能力的IC50（EC50）相关性分析 由Pearson’s 相关性结果可知，小果沙棘叶总黄酮含量与还原力的EC50值呈极显著负相关（P ＜0.01），相关系数为0.978 ；异鼠李素与DPPH• 清除力的 IC50 值、还原力的EC50值呈显著（P ＜0.05）负相关；山奈酚与DPPH• 清除力的 IC50 值、还原力的EC50值呈显著（P ＜0.05）正相关；芦丁与ABTS+• 清除力的IC50 值呈显著（P ＜0.05）正相关；槲皮素与所有检测的抗氧化指标的IC50值相关性均不显著（P ＞0.05）。

表2 小果沙棘叶黄酮含量与抗氧化力IC50（还原力，EC50）相关性分析

3 讨论

3.1 不同省份小果沙棘叶总黄酮与4 种黄酮类化合物含量比较 沙棘中的黄酮含量和主成分因不同产地、不同品种、采摘时间而产生明显的差异。四川产沙棘总黄酮含量为73.9%，明显高于北京产沙棘（20.1%），西藏沙棘、江孜沙棘的总黄酮含量明显高于中国沙棘，而且西藏沙棘中黄酮化合物芦丁含量最高为1976.7 μg/g。中国沙棘6 ～8 月总黄酮的含量最高，且雌株叶高于雄株叶。也有研究表明，沙棘不同采摘部位其黄酮含量也有所差别，沙棘叶黄酮含量最高（Raffo 等，2004）。

本试验对沙棘中较常见的4 种黄酮类化合物含量进行测定，其均具有多种生物活性，如抗氧化、清除自由基、抗炎、抗病毒和免疫调节等作用。付桂香等（1997）与本研究一致表明，新疆XJ 沙棘叶片中芦丁含量最高，通过分析不同国家种植的多个沙棘栽培品种发现，沙棘中主要的黄酮苷元为槲皮素、山奈酚和异鼠李素，其含量分别为3 ～100、2 ～16 和350 ～660 mg/kg ；异鼠李素含量明显高于槲皮素、山奈酚，沙棘果肉黄酮中异鼠李素含量最多，沙棘籽黄酮则是山奈酚含量最多（Di 等，2020），这也从侧面说明本文不同省份小果沙棘叶中黄酮主成分含量不同的原因可能是沙棘产地的气候差异、生态土壤环境差异导致其产量和品质上的差异，进而导致黄酮含量不同，但其富集机制仍有待进一步研究。

3.2 不同省份小果沙棘叶中各黄酮含量与抗氧化能力相关性 自由基易与细胞膜磷脂中多不饱和脂肪酸的碳碳双键发生反应，造成细胞膜破坏，进而引发细胞脂质氧化损伤，导致机体免疫功能失调，引发各种疾病（卢德勋，2021）。黄酮类化合物通过抑制、清除自由基和激活机体抗氧化体系而发挥抗氧化作用。本研究表明，在DPPH•、ABTS+•、O2-•、还原力体系中，5 种小果沙棘叶总黄酮均可有效清除生理和非生理自由基，但就不同省份小果沙棘叶中总黄酮的IC50 值来说，山西SX 和甘肃GS 的沙棘叶总黄酮比其他省的抗氧化能力强，与二者总黄酮含量高有关（付依依等，2021）。大量研究表明，植物活性成分的抗氧化能力与黄酮含量具有一定相关性。陈玉霞等（2007）比较了常见的25 种蔬菜中维生素C、总多酚、总类黄酮的体外抗氧化活性，发现抗氧化活性与总多酚和总黄酮含量之间相关性较大；康超等（2021）研究表明，不同品种芒果黄酮化合物含量与抗氧化能力具有量效关系，且不同来源、产地的沙棘总黄酮抗氧化能力有所差异。

本试验相关性结果表明，小果沙棘叶总黄酮与还原力的EC50值呈显著负相关，与其他抗氧化评价体系不显著，这可能是不同物质在不同抗氧化评价体系中发挥的抗氧化原理不同（Gulcin等，2020）。异鼠李素含量与还原能力的EC50值、DPPH• 的IC50值呈显著负相关，说明小果沙棘叶总黄酮中异鼠李素含量越高抗氧化能力越强；异鼠李素通过PI3K/AKT/PKB，NF-κB，MAPK 信号通路及相关细胞因子和激酶的表达起到抗炎、抗氧化作用（Gong 等，2020）。王苗苗等（2020）对两种新疆沙棘中黄酮体外抗氧化的研究中同样说明沙棘黄酮中异鼠李素的含量越高抗氧化能力越强；这与体内抗氧化的结果相符合（周健等，2021）。山奈 酚 和 芦丁含量与DPPH• 的IC50值、ABTS+• 的IC50呈相反趋势，原因可能是DPPH·和ABTS+• 是非生理的体外抗氧化测定方法，有局限性；且自由基清除活性与酚羟基的位置和酚羟基上H 原子的电荷分布有关。山奈酚和芦丁抗氧化性能可能是通过清除生理性的O2-•发挥抗氧化作用（Gulcin 等，2020）。本研究证明，沙棘小果叶总黄酮含量与抗氧化能力有密切关系，而沙棘小果叶总黄酮的作用机制及沙棘小果叶总黄酮中某种类黄酮化合物与抗氧化能力的关系有待进一步探索。

4 结论

不同省份小果沙棘叶总黄酮含量及其组成均存在差异，其中甘肃GS 小果沙棘叶总黄酮含量最高且抗氧化能力最强，山西SX 小果沙棘叶总黄酮次之。