宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌耐药基因分布及分子分型

李 娜，常佳伟，马 强，马 靓，毛彦妮，康馨匀，王 鑫，王桂琴 (宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)是一种重要的人畜共患致病菌[1-2]，也是引起养殖场奶牛乳腺炎的病原菌之一[3]。近些年，由于抗菌药物在动物临床上的广泛使用，S.aureus对抗菌药物呈普遍耐药和多重耐药，乃至出现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus，MRSA)，给奶牛养殖业和食品卫生安全造成极大威胁。为有效监控S.aureus的感染，对S.aureus分离株进行基因分型，了解其传播机制，最终为临床预防和治疗S.aureus的感染提供流行病学依据[4]。本研究运用PCR方法对234株S.aureus进行了19种耐药基因的检测，并用4种分子分型技术对宁夏地区不同奶牛场乳腺炎奶样S.aureus分离株进行基因分型，探索该地区S.aureus菌株的流行变化趋势及进化特点。

1 材料与方法

1.1 菌株及质控菌株234株S.aureus分离自2017—2018年宁夏银川市、吴忠市、石嘴山市及中卫市等地区部分奶牛养殖场乳腺炎奶样；标准菌株(ATCC29213)购自中国药品与生物制品检定所。

1.2 培养基、试剂及主要仪器科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基购自CHRO Magar公司；MHB肉汤购自北京陆桥技术有限公司；2×Taq PCR Master Mix购自诺唯赞公司；细菌基因组提取试剂盒购自天根生化有限公司，细菌基因组的提取按照试剂盒说明书进行；PCR引物及扩增产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。PCR扩增仪购自美国Applied Biosystems公司;高速离心机购自德国Eeppendorf公司；电泳及成像系统与脉冲场凝胶电流仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 多位点序列分型(MLST)参考文献[5]对金黄色葡萄球菌7个看家基因(arcc、aroe、glpf、gmk、pta、tpi、yqil)引物进行合成和扩增，引物序列及片段大小见表1。PCR反应选用50 μL体系，以55℃为最佳退火温度进行扩增。扩增产物进行电泳、测序和序列分析，并将处理好的序列提交至相关数据库(http://saureus.mlst.net/和https://pubmlst.org/)，最终确定其ST型。

1.4spa分型参考文献[6]与spa分型网络数据库(http://spaserver2.ridom.de/frequencies.shtml),采用PCR和网络数据库对比分析的方法对S.aureus进行spa分型，引物序列及片段大小见表1。PCR反应选用50 μL体系，以60℃为最佳退火温度进行扩增。将扩增产物进行电泳、测序并提交至数据库(http://spa.ridom.de/mLst.shtmL和http://seqtools.com)进行分析，获得spa分型。

1.5 RAPD分型参考文献[7]合成引物对S.aureus进行RAPD分型，引物序列及片段大小见表1。PCR反应选用50 μL体系，以28℃为退火温度进行扩增，将扩增产物电泳，经凝胶成像系统拍照获取图像，通过Quantity One和NTSYS.2.10e软件分析图像并构建树状图。

1.6agr分型参考文献[8]设计合成引物，采用多重PCR方法对234株S.aureus进行agr分型，引物序列及片段大小见表1。PCR反应选用50 μL体系，以55℃为退火温度进行扩增。将扩增产物进行电泳及分析，得出菌株的agr分型。

表1 不同分型PCR引物信息

1.7 耐药基因检测根据文献[9-17]设计合成引物，分别扩增β-内酰胺类耐药基因blaZ；大环内酯类耐药基因ermA、ermB、ermC；氨基糖苷类耐药基因aacA-aphD；酰胺醇类耐药基因fexA； 氟喹诺酮类耐药基因gyrA、grlA、norA；四环素类耐药基因tet(L)、tet(k)、tet(M)、tet(O)；林可酰胺类耐药基因Lin(A)；磺胺类耐药基因Sul1、Sul2、Sul3；恶唑烷酮类耐药基因optrA、cfr等9类共19种耐药基因。PCR反应选用20 μL体系，引物序列、片段大小及退火温度见表2。将扩增产物进行电泳及测序分析。

表2 PCR扩增引物序列和反应运行参数

续表2

1.8 统计学分析用SPSS统计软件对不同分型间携带耐药基因谱间的差异进行卡方检验，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 MLST分型对234株S.aureus进行MLST分型，7个管家基因PCR扩增片段与预期结果一致(图1)。234株菌株每个位点的等位基因编号和MLST型别见表3，所有菌株被分为11种ST型，以ST50为主，占40.60%，其次为ST4053(23.93%)、ST97(18.80%)。

M.DL2000 DNA Marker；1.gmk；2.tpi；3.aroe；4.yqil；5.glpf；6.pta；7.arcc；N.空白对照图1 S.aureus 管家基因PCR结果

表3 S.aureus的 MLST 分型结果

2.2spa分型234株S.aureusspa分型结果见表4。共包含20种基因型，主要以t224型为主，有155株，占66.24%；其次为t518，占6.84%。部分菌株电泳条带见图2。

M.DL2000 DNA Marker；1～7.部分检测样品；N.空白对照图2 部分S.aureus spa基因扩增产物电泳图

表4 S.aureus的 spa 分型结果

2.3agr分型234株S.aureus共包含4种亚型，主要以Ⅰ型为主，有143株菌，占61.11%，其次为agrⅡ型和agrⅣ型，分别有42株菌(17.95%)、31株菌(13.24%)，检出最少的是agrⅢ型有18株菌(7.69%)。

2.4 RAPD分型通过RAPD分型技术对234株S.aureus进行分型，电泳检测结果显示，234株S.aureus中有211株扩增后产生清晰的指纹图谱，扩增条带数在1～5之间，条带相对分子质量在50～2 000 bp之间，清楚地反映菌株间的基因多态性特征(部分菌株电泳图见图3)。从表5中可以看出，牧场1主要以Ⅳ型为主，其次为Ⅲ型，其他几个牧场各个型均有分布。

M.DL2000 DNA Marker；1～13.部分检测样品图3 部分S.aureus RAPD分型电泳图

表5 各牧场金黄色葡萄球菌的RAPD分型分布 株

通过NTsys2.1软件对指纹图谱进行聚类分析，结果见图4，在70%的相似水平上，211株S.aureus分为6个主要聚类群，其中Ⅳ型为本地区主要流行的优势菌群，有68株菌，占29.06%，其次为Ⅰ、Ⅲ型，分别有30(12.82%)，44(18.80%)株菌。

图4 金黄色葡萄球菌部分RAPD分型系统进化树

2.5 耐药基因检测、耐药基因谱及分子特征对234株S.aureus进行了19种耐药基因的检测，共检出13种耐药基因，其中gyrA、norA、grlA3种基因的检出率最高，分别为97.85%，97.85%，95.70%；其次为blaZ基因，检出率为 64.52%；其余9种耐药基因的检出率均低于10%，没有检出tet(O)、optrA、cfr、Sul1、Sul2 和Sul3 耐药基因(图5)。

图5 金黄色葡萄球菌中19种耐药基因的检出率

所有菌株均不同程度地携带多种耐药基因，共形成40种耐药基因谱，携带3种及以上耐药基因的菌株占97.86%(229/234)，携带4种耐药基因的菌株最多，占47.86%(112/234)，其中98株耐药基因谱为grlA-norA-gyrA-blaZ的菌株，有82株spa-t224，84株agr-Ⅰ，63株ST50型与25株RAPD-Ⅳ型；其次是携带3种耐药基因，占34.62%(81/234)，其中47株耐药基因谱为grlA-norA-gyrA的菌株，有32株spa-t224，26株agr-Ⅰ，23株ST4053型与20株RAPD-Ⅳ型(表6)；携带5种耐药基因、7种耐药基因和8种耐药基因的菌株分别占10.26%(24/234)，2.99%(7/234)，1.70%(4/234)；而携带6种耐药基因、9种耐药基因和11种耐药基因的菌株仅有1株，分别占0.43%(图6)。

图6 金黄色葡萄球菌中多重耐药基因检出结果

2.6 不同分型间耐药基因谱携带率的比较spa分型中，t224型与t359、t521、t519菌株耐药基因谱携带率间差异有统计学意义(χ2分别为19.71，21.78，26.47，P<0.01)；agr分型中，Ⅰ与Ⅲ、Ⅳ型菌株耐药基因谱携带率间差异有统计学意义(χ2分别为9.53，23.15，P<0.01)；MLST分型中，ST50与ST97、ST4053型菌株耐药基因谱携带率间差异有统计学意义(χ2分别为25.00，38.48，P<0.01)。

3 讨论

在全球奶牛养殖业中，S.aureus是引起奶牛乳腺炎的重要致病菌之一。随着其耐药性和致病能力的发展，尤其伴随着MRSA流行株的出现，S.aureus对动物和人类的健康已造成严重威胁。更由于不同时期、不同地区流行的S.aureus菌株基因型不同，使S.aureus临床抗感染治疗面临极大挑战[18]。为使临床治疗和防控更具针对性，对该地区S.aureus菌株的变化特点和流行趋势的监测必不可少。

MLST分型技术是一种基于细菌管家基因序列测定的高分辨率分子流行病学研究手段[19]，已被用于鉴定和研究S.aureus克隆体在人类感染和牛乳腺炎中的分布[20]，然而，有关牛源分离株的MLST数据仍然很少。不同国家与地区ST型的流行类型不同，且区域差异较大[19]，欧美地区以MRSA-ST398为主要流行型别，在多种不同的宿主中(包括人、猪、马和小牛等)都有见报道[21-23]，国内动物源MRSA则以ST9为主[24-26]。本研究对234株S.aureus进行了MLST分型，ST50、ST4053和ST97为优势型别，而国内不同地区MLST流行型也不尽相同；北京、内蒙、新疆、山东、山西、浙江等地均有一定数量的牛源S.aureus被分离，优势MLST分型主要集中于ST97和ST398[27]，在本研究中ST97型(44，18.80%)也有被检出，表明ST97已经在我国牛源S.aureus中流行。

有研究表明spa与S.aureus分型的“金标准”脉冲场凝胶电泳(PFGE)的分析结果具有相同的高效性[28]。此外，CELIO等[29]报道，spaX区多态性与生物体对不同条件的适应有关，如不同的宿主群体、天气和地理多样性。本研究结果显示，234株S.aureus被分为20种spa型，其中最常见的spa型是t224型(66.24%)。而在河南、江苏、广州地区流行的spa型分别是t15075、t030、t037[30-32]。t224型作为主要优势菌株在国内其他地区还未见报道，说明我国不同地区S.aureus的spa分型优势菌株不具有唯一性。此外，ASADOLLAHI等[33]研究发现t030是亚洲以及中国主要流行的spa型；t032、t008、t037和t202分别是欧洲、美国、非洲和澳大利亚的spa流行型。研究成果表明，不同来源及不同地理位置的S.aureus对其环境的选择性适应导致spa分型具有多样性。

RAPD分型是一种以DNA基因组中较短序列重复出现的频率为理论依据，建立在PCR技术基础上的DNA分析技术[34]。因其操作简便，耗时短，引物通用等特点被广泛用于微生物的分子分型和鉴定领域的研究。本研究中，宁夏地区S.aureus最主要流行的优势菌群为RAPDⅣ型(29.06%)，其次为Ⅰ、Ⅲ型，这与WANG等[35]的研究结果相似。而在其他报道中[4]Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ与Ⅴ型分别是贵州、上海、甘肃与内蒙古地区主要流行的优势菌群，表明牛源S.aureus的感染随着地区、气候及养殖水平的不同而有较大变化。各牧场菌株基因型分布有明显差异，牧场7内只发现Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ型3种RAPD型，且无明显占优势的基因型，可能与样本数量较少有关，但在一定程度上也反映出牧场7中菌株与其他牧场流行传播较少，所以基因型分布较其他牧场简单。其他牧场各基因型分布广泛，可能是细菌在牧场间流行传播较频繁，菌株基因产生显著变异，但更多应该考虑的原因是养殖环境和管理水平较差导致地区间流行[35]。

在S.aureus中，agr系统负责调控S.aureus毒力因子的表达，利用agr基因位点序列的多态性，可将S.aureusagr分为agrⅠ～Ⅳ型。较spa与RAPD分型，国内agr分子分型在牛乳源S.aureus上的研究报道较少。本研究agr分型结果显示，宁夏地区牛源S.aureus主要为agrⅠ型(61.11%)，与张行等[36]对甘肃、山西、黑龙江和江苏地区S.aureus的分型结果相似，而与陈程[37]在宁夏地区研究结果不同，推测可能与采样时期不同有关。目前已有研究报道，在不同地区优势克隆并不唯一，同一地区不同时期的优势克隆也会发生变化[19]，说明对不同时期S.aureus的流行病学监测是非常重要的。此外，据报道，S.aureusagrⅣ型的流行率较低，检出率通常低于3.70%[38]，本研究中，agrⅣ型的检出率为13.24%，这可能与S.aureus的遗传背景有一定关系，基因背景差异导致不同地域的agr基因型进化出现多样性[39]，但这种不同地域分布特征差异及相关机制有待进一步研究。

S.aureus日趋严重的耐药现象与耐药基因的存在息息相关。本试验结果显示，受试菌株中氟喹诺酮类耐药基因检出率最高，gyrA、norA和grlA基因的携带率分别为97.85%，97.85%，95.70%，与陈程[37]的报道结果相近。值得注意的是，本实验室前期研究表明[40]，本地区S.aureus对氟喹诺酮类抗菌药物环丙沙星的耐药率只有4.70%，这一现象可能与氟喹诺酮类耐药基因的转录与表达水平有关，有待进一步的研究。β-内酰胺类耐药基因blaZ的检出率为64.52%，实验室前期试验表明S.aureus对β-内酰胺类抗生素氨苄西林的耐药率为85.90%，两者之间存在较好的相关性。与此同时，受试菌株对β-内酰胺类药物头孢噻呋的耐药率相对较低，只有10.26%，推测可能与β-内酰胺类抗生素不同种类药物在临床上的用法和用量有关。此外林可酰胺类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因、大环内酯类耐药基因、四环素类耐药基因携带率与耐药表型基本相符。

此外，本研究并未检出Sul1、Sul2和Sul3 磺胺类耐药基因，但实验室前期研究却发现，受试菌株对磺胺类抗菌药物磺胺异恶唑的耐药率达到了63.20%，表明S.aureus耐磺胺类药物的耐药机制不仅与耐药基因的存在及表达相关，也与生物膜等其他耐药因素有关，这与杜伟伟[17]、陈程[37]的报道相符。结果显示，宁夏地区S.aureus耐药基因携带情况呈多样性，氟喹诺酮类和β-内酰胺类耐药基因携带率较高，须对S.aureus耐药基因型进行跟踪调查，明确宁夏地区S.aureus菌株的耐药情况。

本研究对宁夏不同地区的牛乳源S.aureus进行了4种不同分子分型研究。ST50-t224-RAPDⅣ-agrⅠ为宁夏地区主要流行菌株，属于检测和防控的重点对象，且S.aureus菌株分型与携带耐药基因有关。不同地区各牧场菌株基因型分布差异较大，说明S.aureus的流行趋势会随着地理位置、养殖管理水平及采样时期的不同而产生变化。实时监控S.aureus分子流行病学特征，有利于临床抗感染治疗时抗生素的合理选择，降低其在本地区的流行传播，为奶牛乳房炎的防控与治疗提供理论依据。同时S.aureus的各种分子分型方法各有特点，在进行菌株遗传相关性分析时，应根据实际工作需求选择不同分子分型方法对菌株进行综合分析，保证分型结果的高分辨性与可重复性。