从巨噬细胞极化角度分析不同油脂饮食对小鼠腹股沟皮下脂肪组织沉积的影响

严思思 李 鑫 刘翔燕 刘水平 周迎芳 王 吉罗非君 文利新* 林亲录*

(1.中南林业科技大学 食品科学与工程学院/稻谷及副产物深加工国家工程实验室,长沙 410004； 2.湖南农业大学 动物医学院/畜禽保健湖南省工程研究中心,长沙 410128)

近年来，油脂摄入的问题引发了越来越多的争议，争议主要集中在两方面，一方面是脂肪供能水平，另一方面是油脂的质量。油脂摄入过量和脂肪酸摄入不均衡(特别是摄入饱和脂肪酸含量高的油脂)被认为是诱导肥胖的重要因素。2015版美国居民膳食指南仍限制饱和脂肪酸摄入，推荐低于总能量摄入的10%。虽然自上世纪50年代以来，饱和脂肪酸被认为是心血管疾病及相关慢性代谢性疾病的“元凶”，但是近年来，有研究者通过随机双盲对照试验和荟萃分析发现与不饱和脂肪酸相比，饱和脂肪酸摄入与心血管疾病及肥胖的风险无显著差异，说明比较不同脂肪酸组成的油脂摄入对机体脂代谢的影响仍然是值得探索的问题。

菜籽油(富含单不饱和脂肪酸)是中国南方居民消费量较高的食用油，主要脂肪酸为C18∶1，含量可达50%，其次是C18∶2。猪油(富含饱和脂肪酸)是中国居民消费量最高的动物油，主要脂肪酸为C18∶1，含量可达40%，其次是C16∶0和C18∶0，两种饱和脂肪酸总含量可达35%。橄榄油(富含单不饱和脂肪酸)是地中海饮食国家常用食用油，主要脂肪酸为C18∶1，含量可达80%。此外，橄榄油中含有较多多酚、甾醇和维生素E等活性物质，菜籽油中含有较多甾醇和维生素E，猪油中的活性成分含量微少。有研究表明，橄榄油具有抗炎功能。双低菜籽油有助于减肥，而芥酸含量较高的菜籽油会导致肝损伤。猪油高脂饮食(40%脂肪供能)容易导致胰岛素抵抗和脂肪组织炎症，引起脂肪组织中巨噬细胞浸润。这些研究表明，摄入不同油脂与机体炎症状态密切相关，从而影响机体脂质沉积。近年来，大量研究显示，脂肪组织中的巨噬细胞极化与脂肪沉积密切相关。当脂肪组织中蓄积大量的甘油三酯后，脂肪细胞体积增大，脂肪组织内血管供氧不足、脂肪细胞死亡和趋化因子分泌增加，促进巨噬细胞浸润。游离脂肪酸可以与巨噬细胞表面受体Toll样受体4结合，激活下游炎症因子的表达，触发脂肪细胞分泌促炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(Interleukin，IL)-6等，促炎性细胞因子招募和活化M1型巨噬细胞。基于本团队前期研究发现，相较于其他部位，摄入这三种油脂造成皮下脂肪沉积的差异更大，且皮下脂肪组织是脂肪组织巨噬细胞的丰富来源，也是脂肪组织发生棕色化的主要部位，脂肪组织棕色化与巨噬细胞极化密切相关。虽然有研究发现饱和脂肪酸可以诱导巨噬细胞向M1型极化，但是探索摄入不同油脂对脂肪组织中巨噬细胞分型差异的研究较少，因此，从巨噬细胞极化的角度出发可以拓展不同油脂对小鼠脂肪沉积机制的理解。

多数以啮齿动物为模型的油脂营养研究发现饱和脂肪酸含量较高的饮食容易诱导脂肪沉积，而这些实验多数是基于超高脂饮食(40%～60%)所得到的结论，40%～60%脂肪供能的饮食常应用于啮齿动物模拟西方高脂饮食，但是，啮齿动物标准饲料中脂肪供能为10%，超高脂饮食中的脂肪供能为小鼠标准量的4～6倍。实际上，有数据显示，地中海国家和中国大部分居民饮食中的脂肪供能约为30%，30%是中国居民膳食指南推荐脂肪供能(20%～30%)的上限，这些数据说明，中国居民的实际脂肪摄入量仍在推荐范围内，有部分居民脂肪摄入量超标，超过量约为3%～6%，因此，推测用啮齿动物探索脂肪摄入对机体体脂沉积时，不合理的脂肪供能设置可能是对饱和脂肪酸的认识仍存在较大争议的重要因素。基于以上推测，本研究设置2种脂肪功能比，分别为10%和30%，10%脂肪供能是小鼠维持生长所需的脂肪供能水平，即在推荐摄入范围内比较不同油脂对脂肪沉积的影响，另一方面，沿用前人的方法，以中国居民实际脂肪功能比30%设计小鼠饲料，由此可探究，在不同脂肪供能水平不同油脂对脂肪沉积的影响。

综上，本试验旨在探究2种脂肪供能条件下，3种油脂摄入对皮下脂肪组织沉积及巨噬细胞分型的影响，以加深作用机制的理解并为日常油脂摄入提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选取90只7周龄SPF级C57BL/6 J雄性小鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，饲以基础日粮，适应性喂养1周后，随机分为6组，每组15只，饲喂不同脂肪供能水平和不同油脂种类的饲料，分别为10%脂肪供能猪油(Lar-10%)、10%脂肪供能菜籽油(Rap-10%)、10%脂肪供能橄榄油(Oli-10%)、30%脂肪供能猪油(Lar-30%)、30%脂肪供能菜籽油(Rap-30%)、30%脂肪供能橄榄油(Oli-30%)，自由采食和饮水，温度控制在22～26 ℃。试验用猪油采购自唐人神集团股份有限公司的猪板油炼制所得，菜籽油采购自道道全粮油股份有限公司的道道全醇香菜籽油，橄榄油采购自WILMAR食用油私人有限公司的特级初榨橄榄油。试验分组及饲料成分见表1，试验周期为16周，16周后禁食不禁水12 h，摘眼球取血，断颈椎处死，采集腹股沟皮下脂肪，分装保存。

表1 饲料成分
Table 1 Feed ingredient g

日粮组成Lar-10%Rap-10%Oil-10%Lar-30%Rap-30%Oil-30%玉米淀粉468.3468.3468.331031055酪蛋白138138138157.4157.4157.4蔗糖99.999.999.9114114114纤维素505050575757矿物质35353539.939.939.9维生素10101011.411.411.4糊精154.9154.9154.9176.6176.6176.6L-胱氨酸1.81.81.82.12.12.1磷酸氢钙0.10.10.10.10.10.1氯化胆碱2.52.52.52.82.82.8TBHQ0.010.010.010.030.030.03猪油39.600135.400菜籽油039.600135.40橄榄油0039.600135.4合计1 0001 0001 0001 0001 0001 000

1.2 实验方法

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2

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脂肪组织HE染色组织观察及脂肪细胞大小统计

(1)HE染色：取腹股沟皮下脂肪固定于4%中性甲醛，经石蜡包埋，切片后，进行染色处理，依次将切片放入二甲苯Ⅰ18 min，二甲苯Ⅱ18 min，无水乙醇Ⅰ5 min，无水乙醇Ⅱ5分钟，75%酒精5 min，自来水洗5分钟脱蜡，接下来将切片放入苏木素染液(赛维尔生物科技有限公司)染4 min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水缓慢冲洗，接下来再将切片依次放入85%和95%的酒精中脱水5 min，然后再放入伊红染液(赛维尔生物科技有限公司)中染5 min，最后将切片依次放入无水乙醇Ⅰ5 min，无水乙醇Ⅱ5 min，无水乙醇Ⅲ5 min，二甲苯Ⅰ5 min，二甲苯Ⅱ5 min透明，烘干并封片，用CX41光学显微镜(Olympus)进行镜检。

(2)拍照：每张切片在100倍镜下分为左上、左下、中部、右上、右下5个视野区域进行拍照。

(3)统计脂肪细胞大小：分别在左上、左下、中部、右上和右下5个视野区域内随机选择200个完整的脂肪细胞，运用Image-Pro Plus图像分析软件计算脂肪细胞横截面积，其均值作为该视野区域脂肪细胞横截面积有效值，每个样本的脂肪细胞横截面积取5个视野区域有效值的均值。

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2

CD206和CD11c免疫荧光双染

将石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，3%BSA封闭，加入1∶500稀释后的一抗CD206(赛维尔生物科技有限公司)，孵育过夜，加HRP标记的二抗孵育50 min，PBS洗涤，加CY3-TSA(赛维尔生物科技有限公司)孵育10 min，TBST洗涤，组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(赛维尔生物科技有限公司)的修复盒中于微波炉内加热以去除结合到组织上的一抗二抗，加1∶500稀释后的一抗CD11c(赛维尔生物科技有限公司)，孵育过夜，加HRP标记的二抗孵育50 min，加FITC-TSA(赛维尔生物科技有限公司)孵育10 min，TBST洗涤，DAPI(赛维尔生物科技有限公司)复染细胞核，淬灭组织自发荧光，封片。切片置于扫描仪(Pannoramic)下采集图像：DAPI紫外激发波长330～380 nm,发射波长420 nm，发蓝光；FITC激发波长 465～495 nm，发射波长515～555 nm，发绿光；CY3激发波长510～560，发射波长590 nm，发红光，切片于荧光显微镜下观察，采集每种荧光单独图像和合并图像。

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3

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)荧光检测

取腹股沟皮下脂肪的石蜡切片，用组化笔在切片组织周围画圈，加入自发荧光淬灭剂淬灭组织自发荧光(赛维尔生物科技有限公司)，染色，DAPI复染细胞核，用抗荧光淬灭封片剂封片，切片于荧光显微镜下观察并采集每种荧光单独图像和合并图像。

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CD206和CD11c酶联免疫吸附测定(ELISA)将腹股沟脂肪组织和PBS以1 mL ∶ 10 μL (

m

∶

V

)的比例制成组织匀浆，再根据CD11c和CD206试剂盒说明书检测并计算CD11c和CD206含量。

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5

数据处理及作图

所有结果运用SPSS 17.0软件进行方差齐性检验和单因素方差分析，再运用最小显著性差异(LSD)法比较各组数据均值显著性，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 不同油脂制成的饲料对小鼠腹股沟皮下脂肪组织重量的影响

由图可知，Lar-10%、Rap-10%和Oil-10%组的腹股沟皮下脂肪组织重量相比较，无差异显著性；Lar-30%、Rap-30%和Oil-30%组的腹股沟皮下脂肪组织重量分别显著高于Lar-10%(

P

<0.01)、Rap-10%(

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<0.05)和Oil-10%(

P

<0.05)组，且Lar-30%组的腹股沟皮下脂肪组织重量显著高于Rap-30%和Oil-30%(

P

<0.05)组。在10%脂肪供能水平下，摄入不同油脂制成的饲料对小鼠腹股沟皮下脂肪组织重量无显著影响，脂肪供能由10%增加至30%后，摄入猪油、菜籽油和橄榄油制成的饲料均会显著增加腹股沟皮下脂肪沉积(

P

<0.05)，但是摄入高脂猪油的小鼠腹股沟皮下脂肪沉积显著高于摄入高脂菜籽油和橄榄油的小鼠(

P

<0.05)。

2.2 不同油脂制成的饲料对小鼠腹股沟皮下白色脂肪细胞的影响

不同油脂对小鼠腹股沟皮下脂肪细胞横截面积的影响如图2所示，Lar-10%与Oil-10%组腹股沟皮下脂肪细胞横截面积大部分在600 μm以下，Rap-10%组大部分在200～600 μm。Lar-30%组腹股沟皮下脂肪细胞横截面积大部分在600 μm以上，少部分在200～600 μm，Rap-30%组大部分在200～600 μm，少部分低于200 μm或超过1 000 μm。

各组间相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。下同。The identical letter means no significant difference among the groups, and different letters mean significant difference. The same below.图1 不同油脂制成的饲料对小鼠腹股沟皮下脂肪组织重量的影响Fig.1 Effects of different oils and fats diets on inguinal subcutaneous white adipose tissue weight in mice

图2 不同油脂制成的饲料对小鼠腹股沟皮下脂肪细胞横截面积的影响(20×)Fig.2 Effects of different oils and fats diets on cross-sectional area of inguinal subcutaneous adipocytes in mice (20×)

Oil-30%组几乎都在200～600 μm。在较低脂肪供能水平，猪油饲料饲喂的小鼠脂肪细胞横截面积最小，但脂肪供能增加至30%后，猪油饲料饲喂使脂肪细胞增大，低脂猪油可以促进腹股沟皮下脂肪组织棕色化。

2.3 不同油脂制成的饲料对小鼠腹股沟皮下脂肪组织中ROS含量的影响

不同油脂对小鼠腹股沟皮下脂肪细胞ROS定位及含量的影响如图3所示，由图3(a)可知，Lar-10%、Rap-10%、Oli-10%和Oli-30%组的ROS集中于细胞核的位置，而Lar-30%和Rap-30%组的ROS在细胞质中也大量富集。经过荧光强度扫描，ROS荧光密度结果如图3(b)所示，Lar-30%与Rap-30%组小鼠腹股沟皮下脂肪细胞ROS水平极显著高于Oli-30%组(

P

<0.01)。结果表明，在较低脂肪供能水平，3种油脂饲料饲喂的小鼠腹股沟皮下脂肪细胞ROS水平无显著差异，脂肪供能增加至30%，仅猪油和菜籽油饲料饲喂的小鼠ROS水平显著升高(

P

<0.05)，橄榄油饲料饲喂可以避免ROS的增加。

DAPI,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DNA染料)；ROS,活性氧；Merge,DAPI和ROS荧光合并DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; ROS, reactive oxygen species; Merge, overlap fluorescent staining of DAPI and ROS.图3 不同油脂制成的饲料对小鼠腹股沟皮下脂肪细胞(a)ROS荧光定位和(b)ROS荧光密度的影响Fig.3 Effects of different oils and fats diets on (a) ROS fluorescence localization and (b) ROS optical density in inguinal subcutaneous adipocytes of mice

2.4 不同油脂制成的饲料对小鼠腹股沟皮下脂肪组织中巨噬细胞分型的影响

通过ELISA方法检测了各组小鼠腹股沟皮下脂肪中M2型巨噬细胞标记物CD206和M1型巨噬细胞标记物CD11c的含量，结果如图4所示，由图4(a)和(b)可知，Lar-10%、Rap-10%和Oli-10%组的CD206和CD11c含量无显著差异(

P

>0.05)，但是Oli-10%组的CD11c含量有低于Lar-10%和Rap-10%的趋势。当脂肪供能从10%增加至30%，Lar-30%和Oli-30%组小鼠腹股沟皮下脂肪组织中M2型巨噬细胞标记物CD206的含量和M1型巨噬细胞标记物CD11c的含量都分别显著高于Lar-10%和Oli-10%组(

P

<0.05)。在30%脂肪供能水平，Oli-30%组小鼠皮下脂肪组织中CD206含量显著高于Rap-30%组的小鼠(

P

<0.05)。CD206/CD11c的值如图4(c)所示，Oli-10%组的CD206/CD11c值显著高于Lar-10%和Rap-10%组(

P

<0.05)，Oli-30%组CD206/CD11c值也高于Lar-30%和Rap-30%组，且与Lar-30%组比较差异显著(

P

<0.05)。此外。通过荧光免疫方法标记了CD206(红色)和CD11c(绿色)，由图5可知，CD206和CD11c均在细胞间隙处呈现较强荧光表达，Lar-10%和Oli-10%组的CD206和CD11c荧光强度低于Lar-30%和Oli-30%，且Merge表明，Oli-30%组中CD206/CD11c高于Lar-30%组，Rap-30%组的CD206和CD11c的荧光强度与Lar-30%和Oli-30%相比较低，该结果与ELISA检测结果基本一致。结果表明，同种油脂比较，高脂饲料会导致小鼠巨噬细胞增加，但是不影响皮下脂肪组织中M2和M1型巨噬细胞的比例；另一方面，在同种脂肪供能条件下，橄榄油制成的饲料饲喂小鼠会增加M2/M1型巨噬细胞的比例。

图4 不同油脂制成的饲料对小鼠腹股沟皮下脂肪细胞CD206含量(a)、CD11c含量(b)和CD206/CD11c值的影响(c)Fig.4 Effects of different oils and fats diets onCD206 content (a), CD11c content (b), and value of CD206/CD11c (c) in inguinal subcutaneous adipocytes of mice

DAPI，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DNA染料)；CD206，甘露糖受体C-1型；CD11c，整合素亚单位αX；Merge，DAPI，CD206和CD11c荧光合并DAPI， 4′,6-diamidino-2-phenylindole; CD206， mannose receptor C-1; CD11c， integrin subunit αX; Merge， overlap fluorescent staining of DAPI, CD206, and CD11c图5 不同油脂制成的饲料对小鼠腹股沟皮下脂肪细胞CD206和CD11c分布的影响Fig.5 Effects of different oils and fats diets on CD206 and CD11c distribution in inguinal subcutaneous adipocytes of mice

3 讨 论

研究表明，不合理的油脂饮食可导致机体过度的脂肪蓄积，脂肪过度堆积容易导致ROS的积累和炎症反应，而巨噬细胞是脂肪组织中的主要炎症细胞。根据巨噬细胞的功能，可将其分为M1和M2两种亚型，M1型巨噬细胞被称为经典激活的巨噬细胞，响应辅助型T细胞1表现为促炎表型，M2型巨噬细胞又被称为条件性激活的巨噬细胞，响应辅助型T细胞2表现为抗炎的表型，分泌IL-10和IL-13等抗炎因子。

本研究发现，在10%脂肪供能水平，不同油脂饲料饲喂对小鼠腹股沟脂肪组织重量无显著影响，这些结果提示，在正常脂肪供能水平，三种油脂饮食不会导致肥胖形成，增加脂肪摄入显然会增加腹股沟脂肪组织沉积，无论是摄入高脂猪油还是摄入高脂菜籽油或高脂橄榄油，都无法避免高脂饮食刺激诱导的脂肪组织沉积。2018年发表于

Cell

Metabolism

的研究也证实导致肥胖的确实是脂肪摄入量而不是蛋白质和碳水化合物。然而同样是30%高脂饮食，摄入不同油脂对“高脂刺激”的反应不一致，相较于猪油，摄入菜籽油和橄榄油能有效降低“高脂刺激”导致的皮下脂肪沉积。其他研究也表明，不同油脂(猪油、棕榈油、橄榄油、茶籽油、菜籽油、葵花籽油)高脂饮食均会诱导肥胖，但相较于其他油脂，猪油高脂饮食导致的脂肪沉积更多。然而，在10%脂肪供能条件下，摄入3种油脂对小鼠脂肪沉积没有显著差异，据此推测，油脂中其他活性物质的含量可能是导致猪油高脂饮食小鼠皮下脂肪沉积高于菜籽油高脂饮食和橄榄油高脂饮食小鼠的更重要的因素，因为无论是10%脂肪供能还是30%脂肪供能，油脂中的脂肪酸比例始终保持不变，当机体面临“高脂刺激”，菜籽油和橄榄油中丰富的甾醇、维生素E和多酚可以有效“对抗”脂肪沉积。维生素E和多酚均被证明能改善猪油高脂饮食诱发的脂代谢紊乱。

在高脂饮食条件下，尽管菜籽油饲料饲喂的小鼠腹股沟脂肪组织重量与橄榄油饲料饲喂的小鼠无显著差异，但菜籽油饲料饲喂的小鼠脂肪组织中ROS含量及CD206/CD11c值显著高于橄榄油饲料饲喂的小鼠，该结果可能与菜籽油中含量较高的芥酸有关。有研究表明，摄入高芥酸菜籽油会导致氧自由基积累，芥酸含量10%以上会抑制大鼠的生长性能和长链脂肪酸的氧化速率，市场上常见的菜籽油芥酸含量通常可达到10%，低芥酸菜籽油(0.2%)能降低血脂并增强抗氧化能力。

无论在10%脂肪供能水平还是30%供能水平，摄入橄榄油的小鼠腹股沟皮下脂肪组织重量和脂肪组织中ROS含量均较低，且CD206/CD11c的比值显著高于摄入猪油和菜籽油的小鼠，这可能与橄榄油中含有较多的维生素、多酚和植物甾醇等活性成分有关。Li等检测了多种食用油中的维生素E、总多酚和甾醇含量，猪油中的维生素E含量为75 mg/kg，其中α-生育三烯酚为53 mg/kg，橄榄油中的总维生素E含量为333 mg/kg，是猪油的4倍，并且以α-生育酚为主(307 mg/kg)， 此外，橄榄油中还含有大量的多酚(238 mg/kg)和植物甾醇。尽管菜籽油中的总维生素E和植物甾醇含量远高于橄榄油，但芥酸含量也远高于猪油和橄榄油。正常个体的脂肪组织中巨噬细胞比例较低且以M2巨噬细胞为主，而当个体肥胖后，巨噬细胞比例可由10%增加至50%，并且主要增加的是促炎性的M1型巨噬细胞，促进分泌炎症因子肿瘤坏死因子-α、IL-6，促进产生NO和ROS。ROS包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等，过量的ROS会降低机体抗氧化能力，增加细胞损伤。脂肪组织中的巨噬细胞极易受微环境的影响发生极化，在干扰素-γ和toll样受体的刺激下，可极化形成M1巨噬细胞，在IL-4、IL-13和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ等的刺激下可极化形成M2巨噬细胞。本研究中，3种高脂饮食诱导了小鼠脂肪沉积，猪油高脂饮食和橄榄油高脂饮食均导致脂肪组织中巨噬细胞增加，猪油高脂饮食刺激巨噬细胞向M1型极化，而橄榄油高脂饮食刺激巨噬细胞向M2型极化，因此，摄入橄榄油的小鼠CD206/CD11c值显著高于摄入猪油和菜籽油的小鼠。大量研究显示，植物多酚可以使巨噬细胞由M1型向M2型极化，从而降低炎症反应，减少脂肪沉积，但是很少有研究报道维生素E和植物甾醇对M1/M2的调节作用。来源于橄榄的多酚在体内和体外试验中均被证明能提高M2型巨噬细胞的比例。Lama等发现，与无多酚的橄榄油比较，富含多酚的初榨橄榄油可以减低线粒体耦合度，减少过氧化氢的产生。

综上所述，在正常脂肪供能水平，油脂的种类对皮下脂肪沉积无显著影响，高脂饮食条件下，橄榄油饮食可以通过减少巨噬细胞向M1型转化，从而降低脂肪组织中ROS含量并减少皮下脂肪沉积，这可能与橄榄油中丰富的活性成分多酚等有关。本研究结果暗示用啮齿动物探究油脂摄入对脂代谢的影响时，不合理的脂肪供能可能是饱和脂肪酸被认为“健康杀手”的因素之一。

日常饮食中首先限制油脂摄入量以控制肥胖的发生，在猪油、菜籽油和橄榄油几种日常膳食油脂中，橄榄油是最佳选择，对于习惯食用菜籽油的家庭，可能选择低芥酸菜籽油更佳。