不同包装材料对NFC橙汁常温贮藏品质的影响

黄林华，蔡德萍，郭莉，谈安群，谭祥

国家柑桔工程技术研究中心/西南大学柑桔研究所，重庆 400712

柑橘类水果中含有黄烷酮、酚酸、柠檬苦素、L-抗坏血酸、类胡萝卜素、挥发性萜烯等多种生物活性化合物，具有抗氧化[1-2]、抗肿瘤[3]和抑菌[2]等作用。橙汁不仅富含VC、多酚等多种功能性营养成分，更因其诱人的色泽和清爽的酸甜口味而受到消费者的青睐，成为全球最受欢迎的果汁品类之一[4]。非浓缩还原（not from concentrate，NFC）橙汁是将新鲜甜橙榨汁、杀菌后直接灌装冷藏，不经过浓缩及复原，最大程度地保留甜橙原有的新鲜风味和营养成分。从微生物安全的角度来看，橙汁属于高酸类食品（pH＜4.6），经巴氏杀菌得到的橙汁在室温下稳定安全[5]。然而在避光贮藏期间，橙汁的感官和营养品质仍会发生变化，主要是由于顶部空间的氧气和透过包装材料的氧气不断溶解在橙汁中[6]，与橙汁中的营养物质发生氧化反应，如橙汁中VC的氧化降解[7]、酚类化合物发生氧化缩合形成褐色物质[8]以及类胡萝卜素的氧化异构化[9]等，导致橙汁整体品质不断降低。

科研人员大多仅研究新型包装材料对橙汁品质的影响，如纸铝塑复合包装[10]、具有吸氧功能的包装材料[11]；或者通过气体交换去除包装容器内的氧气，研究贮藏过程中橙汁品质的变化，如充入N2和CO2[12]。然而，鲜有学者研究NFC橙汁贮藏过程中溶解氧含量的变化规律及其对橙汁贮藏营养品质的影响。而目前NFC果蔬汁的低温贮藏和货架期短是其储运销成本较高的主要原因，也是导致该类产品价格高、市场接受度低的重要因素。

本研究采用不同透氧性的包装材料灌装橙汁，观察常温贮藏过程中溶解氧（dissolved oxygen，DO）含量的动态变化，研究其变化与橙汁贮藏品质的关系，从而明确NFC橙汁常温贮藏中DO值控制参数，为实现NFC橙汁的常温贮藏、延长其货架期、降低储运成本提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长叶香橙（Citrus sinensis（L.）Osbeck），2019年3月采摘于西南大学柑桔研究所果园。

Pertifilm TM测试片（菌落总数、金黄色葡萄球菌、大肠菌群、霉菌/酵母菌）购于3M中国有限公司；NaOH、酚酞、邻苯二甲酸氢钾、草酸等试剂均为化学纯，购于重庆川东化工有限公司；冰乙酸、甲醇等为色谱纯，购于美国Sigma-Aldrich公司。

玻璃（glass，GL）瓶，购于徐州聚霖玻璃制品有限公司；聚丙烯（polypropylene，PP）瓶，购于河北沧州东盛塑料有限公司；聚乙烯（polyethylene，PE）蒸煮袋，购于河北保定龙兴包装有限公司。

GL、PP和PE均为无色透明材料，各包装材料的性能见表1。

表1 包装材料性能Table 1 Packaging material performance

1.2 仪器与设备

S9溶氧仪，梅特勒托利多（上海）有限公司；Color i5色差仪，瑞士Gretag Macbech公司；TU-1901紫外-分光光度计，普析通用仪器有限责任公司；WAY-2S阿贝折光仪，上海精密科学仪器有限公司；1260 infinity高效液相色谱仪（HPLC-DAD），安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 橙汁样品处理

长叶香橙鲜果于西南大学柑桔研究所中试车间内经清洗、分级、压榨、精滤、真空脱气后，在杀菌管道内进行巴氏杀菌（95℃，30 s），然后在灌装室内取样至无菌操作台，立即分别热灌装至灭菌的GL瓶、PP瓶、PE蒸煮袋（透氧性：GL＜PP＜PE）中，灌装至顶空空隙小于0.1 cm，密封，冷水浴中冷却至室温，最后放置在恒温培养箱中，于25℃（模拟室温）下用多层黑色塑料膜包裹避光贮藏。所有样品准备2个平行，每个样品重复测定3次，分别在第0、3、7、15、30、60和120天时取样测定，当感官评定总分低于50分的样品不再进行理化指标测定。以第0天的橙汁样品作为空白对照样品。

1.4 测定指标

1）感官评定。参照GB/T 16291.2—2010《感官分析：选拔、培训和管理评价员一般导则：第二部分：专家评价员》的要求对小组成员进行培训，要求评定人员对标准橙汁的感官属性非常熟悉。感官评价指标为色泽、气味、滋味和状态与杂质，评定时均采用10分制，8～10分为标准，5～7分为合格，0～4分则为不合格[14]。总体评价结果以100分计，各指标的加权系数为色泽（20%）、气味（30%）、滋味（30%）和状态与杂质（20%），低于60分视为该橙汁样品不被接受。

2）溶解氧（DO）测定。使用S9溶氧仪进行侵入型测定，测定前对溶氧仪进行两点校准，校准结束后在氮气环境中测定样品，测定时轻微晃动溶氧仪，每个样品测定5次。

3）色泽的测定。Color i5色差仪开机后选择光源C-02，设定测试参数L*、a*、b*值，用黑白板进行校正，校正结束后每个样品平行测定5次，并计算ΔE值。

4）褐变度（A420）的测定。国内外通常用A420作为果汁非酶褐变的指标，主要是因为非酶褐变反应所产生的色素在420 nm处有非常强的吸光值，吸光值越大，褐变就越严重[15]。参考韩智等[16]的测定方法加以修改。取6 mL样品于10 000 r/min条件下离心20 min，转移3 mL上清液，加入等体积95%乙醇，充分振荡混合，再在10 000 r/min条件下离心20 min，于420 nm处测定吸光值，平行测定3次。

5）还原糖含量的测定。根据行业标准NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的测定 3，5-二硝基水杨酸比色法》进行测定。以葡萄糖为标准品，根据标准中的方法制作标准曲线，所得回归方程：y=0.0491x+0.0074，式中y为质量浓度，x为吸光度，R2=0.995 9。

6）抗坏血酸（VC）的测定。根据GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》第三法——2，6-二氯靛酚法进行测定，结果以每100 g橙汁所含L-抗坏血酸质量表示（mg/100 g）。

7）类黄酮化合物（芦丁、橙皮苷和香蜂草苷）的测定。称取2份平行试样6 g于50 mL离心管中，加入8 mL乙酸乙酯，涡旋混匀5 min，于8 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，重复上述操作1次，合并上清液，氮吹浓缩至干，50%甲醇溶液定容至2 mL，经0.22 μm微孔有机滤膜过滤后，高效液相色谱仪进样20 μL进行检测。将芦丁、橙皮苷和香蜂草苷标准品配制成不同浓度梯度的混合溶液上机检测，制得3种类黄酮化合物的标准曲线回归方程，见表2。检测条件：色谱柱为AcclaimTM120 C18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为1%冰乙酸（A）和甲醇（B）。梯度洗脱程序：0 min 75%A，25%B；30 min 55%A，45%B；50 min 0%A，100%B；60 min 75%A，25%B；75 min 75%A，25%B。流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长283 nm。

表2 酚酸及类黄酮特征化合物的标准曲线回归方程Table 2 Standard curve regression equation for the characteristic monomer of phenolic acids and flavonoids

8）酚酸类化合物（阿魏酸、对香豆酸和咖啡酸）的测定。称取2份平行试样6 g于50 mL离心管中，加入5 mL 8 mol/L的NaOH溶液，涡旋混匀反应1 h；8 mol/L的HCl调节pH至2.0，加入8 mL乙酸乙酯和甲基叔丁基醚（体积比1∶1）混合液，于10 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，重复上述操作1次，合并上清液，氮吹浓缩至干，50%甲醇溶液定容至2 mL，经0.22 μm微孔有机滤膜过滤后，高效液相色谱仪进样20 μL进行检测。将阿魏酸、对香豆酸和咖啡酸标品配制成不同浓度梯度的混合溶液上机检测，制得3种酚酸化合物的标准曲线回归方程，见表2。检测条件：色谱柱为AcclaimTM120 C18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为1%冰乙酸（A）和甲醇（B）。梯度洗脱程序：0 min 80%A，20%B；22 min70%A，30%B；52min0%A，100%B；60min80%A，20%B；66 min 80%A，20%B。流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长为260 nm和320 nm。

9）微生物检测方法。菌落总数的检测参照《3M Pertrifilm TM菌落总数测试片法》进行检测。大肠菌群的检测参照《3M Pertrifilm TM大肠菌群测试片法》进行检测。霉菌及酵母菌的检测参照《3M Pertrifilm TM霉菌及酵母菌测试片法》进行检测。金黄色葡萄球菌的检测参照《3M Pertrifilm TM金黄色葡萄球菌测试片法》进行检测。以上微生物检测在NFC橙汁冷藏结束（180 d）时进行。目前国标对于NFC果汁的微生物指标没有明确规定，所以根据GB 7101－2015《食品安全国家标准饮料》和GB 29921—2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》等标准，将对NFC橙汁中的微生物进行严格控制。

1.5 数据处理

本试验所有样品重复测定3次，测试结果以“平均值±标准差”表示。使用Origin 8.5软件进行相关图的绘制，利用SPSS 11.5统计软件对数据进行两因素交互方差分析，采用Duncan’s法比较平均值之间的差异性，P＜0.01表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 贮藏过程中不同包装内DO值的变化

由图1可知，在贮藏过程中，PE包装中的DO值升高幅度最大，其次是PP包装，GL包装中最低，这与3种包装材料的透氧性（PE＞PP＞GL）大小一致。GL包装的橙汁中DO值整体趋势平稳，基本维持在0.5 mg/L左右。而PP和PE包装的橙汁中DO值变化趋势一致，均呈现先升高、而后迅速降低、最后逐渐升高至平稳的趋势，出现这一变化的可能原因是在贮藏初期，初始DO值低，限制了橙汁中的氧化反应速度，所消耗的溶解氧小于溶解在橙汁中的透过氧，DO值升高；当DO值达到一定量后，橙汁中的氧化反应加速，消耗的溶解氧大于溶解在橙汁中的透过氧，DO值下降；而后橙汁中的氧化反应底物大量减少，氧化反应又逐渐减缓，消耗的溶解氧小于溶解在橙汁中的透过氧，贮藏后期PP和PE中的DO值逐渐升高，直至保持稳定。

图1 不同包装材料中DO值的变化Fig.1 Changes of dissolved oxygen content in different packaging materials

2.2 感官评价

图2、3分别是评价人员对GL、PP、PE包装橙汁样品各感官指标的评分和总体评分结果。由图2可见，对照组橙汁（贮藏0 d）的滋味为酸甜适中，略带苦味，气味新鲜怡人，具有橙子本身的鲜甜味。随着贮藏时间延长，PP和PE包装中橙汁逐渐褐变，出现絮状漂浮固形物，能闻到不同程度的焦糖味，缺少了橙汁的新鲜风味；玻璃瓶中橙汁滋味和气味大体上都没有明显变化。当橙汁开始发生劣变时，3种包装的橙汁样品的气味和滋味2个感官指标变化最为明显，其次是色泽，橙汁的状态相对稳定。PE包装的橙汁样品的感官总分在贮藏15 d后低于60分，但气味和滋味2个感官指标评分在贮藏7 d时已经低于6分。由图3可见，PP中的橙汁在30 d时总分也已经低于60分；但GL中的橙汁在贮藏60 d时感官评价总分仍高于60分，说明该橙汁仍能被消费者接受。通过方差分析发现，3种不同透氧性的包装对橙汁感官评价总分的影响差异显著（P＜0.01），说明降低橙汁的DO值对保持橙汁的良好感官品质至关重要。

图2 GL（A）、PP（B）、PE（C）包装橙汁感官指标评分雷达图Fig.2 Orange juice sensory index score radar chart of GL（A），PP（B）and PE（C）

图3 不同包装的橙汁的感官评价总分Fig.3 Orange juice sensory evaluation score of GL，PP and PE

2.3 贮藏过程中不同包装橙汁色泽的变化

由表3可知，随着贮藏时间延长，所有橙汁样品的L*值均下降，但在120 d时GL包装中橙汁的L*值仅降低2%，肉眼无法直接辨别出差异，而PP和PE包装中橙汁的L*值分别降低了13%和23%；这说明随着包装的透氧量增加，橙汁的DO值越高，氧化反应越快，加速了橙汁的色泽褐变。a*表示红绿值，所有橙汁样品的a*值均为正值，且随着贮藏时间延长而增加，说明橙汁的色泽逐渐变红；在贮藏120 d时，PP和PE中橙汁的a*值分别上升了38%和74%，GL中a*值仅上升了12%。GL、PP和PE中橙汁的b*值在贮藏120 d时分别下降了9%、37%和45%，即橙汁的黄色值在逐渐下降，贮藏过程b*值的增加可能是VC氧化降解、美拉德反应和酚类氧化聚合共同作用的结果。除此之外，橙汁中的类胡萝卜素氧化异构化，导致黄色色素减少，b*值下降。ΔE代表橙汁整体色泽变化的理论参考值，一般认为2≤ΔE＜4时，颜色变化肉眼可见，但在特定情况下可接受；ΔE≥4视为色差严重至无法接受[17]。GL包装中橙汁的ΔE值在120 d时仅为3.72，在感官指标评分（图2）中，该橙汁样品的色泽评分也高于6分，仍在合格范围内，而PP和PE中橙汁在贮藏30 d时，ΔE＞4。通过方差分析发现，贮藏时间和不同透氧性包装材料对橙汁的L*值、a*值、b*值和色差ΔE的影响均呈极显著差异（P＜0.01），GL包装效果最好。

表3 贮藏过程中橙汁色泽的变化Table 3 Changes of color of orange juice during storage

2.4 贮藏过程中不同包装橙汁褐变度（A420）的变化

由图4可知，A420随贮藏时间的延长逐渐增加，表明橙汁的褐变度逐渐变得严重。在贮藏60 d时，PP和PE包装中橙汁的A420均是第0天的3倍，而GL包装中的A420在贮藏过程中没有显著性变化。通过方差分析发现，不同透氧性包装对A420的影响具有显著性差异（P＜0.01），表明不同包装材料对橙汁的褐变度影响差异较大。

图4 贮藏过程中褐变度（A420）的变化Fig.4 Changes of browning index（A420）during storage

2.5 贮藏过程中不同包装橙汁还原糖的变化

图5显示，3种橙汁样品中的还原糖含量在贮藏前期均有小幅下降，而在贮藏后期不断上升。PP和PE包装中橙汁的还原糖含量在贮藏7 d后开始逐渐增加，而GL中的还原糖含量在贮藏15 d后开始增加。并且通过方差分析发现，贮藏时间和不同透氧性包装材料对橙汁还原糖含量的影响差异极显著（P＜0.01）。

图5 贮藏过程中还原糖含量的变化Fig.5 Changes of reducing sugar content during storage

2.6 贮藏过程中不同包装橙汁VC的变化

在有氧条件下，VC发生有氧降解形成脱氢抗坏血酸，经一系列反应后最终生成还原酮，还原酮再参与美拉德反应生成黑褐色物质；在无氧条件下VC也会发生降解，但速度比有氧降解慢。图6显示，VC含量整体呈下降趋势，在贮藏30 d时，PP和PE包装中的VC含量均下降了92%，而GL包装中的VC含量仅减少了13%，说明透氧性低的GL包装中DO值低，对橙汁的VC具有很好的保护作用。该结果与本试验中溶解氧和褐变指数在30 d发生急剧变化一致，或可进一步佐证橙汁褐变主要由美拉德反应、VC降解及酚类物质氧化聚合引起。虽然PP和PE 2种包装的透氧性不同，包装内的DO值也不同，但通过方差分析发现，PP和PE 2种包装对VC含量的影响没有显著性差异。

图6 贮藏过程中VC含量的变化Fig.6 Changes of VCcontent during storage

2.7 贮藏过程中不同包装橙汁类黄酮化合物的变化

为探究不同DO值变化对橙汁中类黄酮化合物的影响，以含量较为丰富的橙皮苷、芦丁和香蜂草苷为代表进行分析，结果如图7所示。通过数据分析发现，橙皮苷、芦丁和香蜂草苷的质量浓度与DO值均不具有显著相关性。3种类黄酮化合物的质量浓度在贮藏前期均呈现下降趋势，而后均出现升高，在贮藏后期又逐渐下降。

图7 贮藏过程中橙皮苷（A）、芦丁（B）和香蜂草苷（C）含量的变化Fig.7 Changes of the contents of hesperidin（A），rutin（B）and didymin（C ）during storage

2.8 贮藏过程中不同包装橙汁酚酸类化合物的变化

为了探究橙汁贮藏过程中DO值对酚酸化合物的影响，选择以占比相对较多的阿魏酸、咖啡酸和对香豆酸为代表进行测定，其结果如图8所示。3种酚酸化合物在波动中呈现先下降、后上升最后再逐渐下降的趋势，这与3种类黄酮化合物的变化趋势一致，推测变化原因类似。通过分析发现，包装材料的透氧性与阿魏酸、对香豆酸和咖啡酸含量之间虽然不具有线性相关性，但降低DO值对各酚酸化合物具有良好的保护作用。在贮藏结束时，GL包装中各酚酸化合物含量较初始值略低或相当。

图8 贮藏过程中阿魏酸（A）、对香豆酸（B）和咖啡酸（C）含量的变化Fig.8 Changes of ferulic acid（A），p-coumaric acid（B）and caffeic acid（C）during storage

2.9 不同包装NFC橙汁常温贮藏中微生物变化

随着橙汁样品的贮藏温度升高，橙汁中残存微生物的生长情况可能发生变化。对常温贮藏温度下NFC橙汁中微生物的变化进行监测。经试验检测发现，常温贮藏至180 d时，GL、PP和PE包装橙汁的菌落总数对数值分别为1.18、0.30和1.02。根据GB 7101－2015《食品安全国家标准饮料》，其菌落总数均属于合格范围。除此之外，橙汁样品中的其他微生物，如大肠菌群、霉菌、酵母菌和金黄色葡萄球菌等均未检出。结果表明，所有的橙汁样品中的微生物指标均在合格范围内，推测在贮藏期间，橙汁样品的各种理化指标受微生物繁殖的干扰甚微。

3 讨论

橙汁中DO值过高，不仅会引起营养物质发生氧化降解，还有助于好氧菌的生长繁殖，加速橙汁风味和营养品质劣变[15]。本研究将橙汁灌装至不同透氧性的包装中贮藏，分析不同包装橙汁在常温贮藏过程中DO值变化，通过感官评价和理化指标分析发现，橙汁的品质与DO值和包装的透氧性密切相关。PE包装透氧性最大，DO值最高，品质劣变最快；其次是PP包装；GL包装最有利于橙汁品质的保持。GL包装中橙汁DO值一直维持在0.5 mg/L左右，可能原因是GL包装透氧率低，可利用的DO有限，使得整个贮藏过程中氧化反应极慢，消耗的DO与溶解在橙汁中的透过氧保持动态平衡[18-19]。橙汁的VC、酚酸类化合物等得到较好的保留，A420没有显著性变化，说明褐变度不严重。

VC降解速率可通过动力学模型进行定量描述，降解速率常数K的绝对值越小，表明降解速率越慢。通过分析发现，3种不同包装中的VC降解均符合一级降解动力学模型，GL、PP和PE包装中Vc的降解速率常数K分别为-0.057 4±0.002、-1.271 8±0.001和-1.224 7±0.006，说明GL包装中VC的降解速率最慢，该结果与Wibowo等[20]的研究结果一致。橙汁褐变主要由美拉德反应、VC降解及酚类物质氧化聚合引起，该结果与VC的结果相互印证，并且与Bacigalupi等[11]研究的结果一致。还原糖含量前期有所下降，可能是由于美拉德反应消耗还原糖的速率大于还原糖生成的速率，还可能和羟基自由基与葡萄糖反应有关[21]，后期不断上升，分析原因为随着蔗糖、果胶、纤维素等水解以及果肉悬浮物中的可溶性糖溶出，导致还原糖生成的速率大于美拉德反应的速率，该变化与吴敏[19]研究荔枝汁的还原糖在贮藏期内的变化趋势类似。PP和PE包装橙汁比GL包装橙汁还原糖含量先上升，出现这种差异的可能与PP和PE包装橙汁中较高的DO加速了还原糖的生成反应有关[19]。

通过进一步分析发现，橙皮苷的减少量最大，其次是芦丁，香蜂草苷最少，出现该现象除与橙汁中黄酮化合物本身的含量有关外，由于黄酮类化合物结构中常含有酚羟基、甲基、甲氧基等取代基团，酚羟基的甲基化或糖基化会都降低柑桔酚类物质的自由基清除能力，而且自由羟基所含数目与抗氧化能力呈显著正相关[22-23]。由于类黄酮属于多酚类化合物，推测含量减少可能由类黄酮化合物消耗水中溶解氧发生氧化缩合反应所引起，而含量增加可能与果肉细胞中类黄酮化合物溶出有关[24]。GL包装的NFC橙汁在常温避光贮藏条件下，感官评价的可接受时间达到60 d，有效延长了橙汁的常温贮藏时间。本文研究结果发现橙汁贮藏过程中溶解氧的变化与橙汁颜色、风味和营养成分含量变化具有较大相关性，但溶解氧在橙汁贮藏过程品质劣变的作用机制和反应途径有待进一步的研究。