二氧化硅纳米颗粒致HUVEC内质网应激的机制

姜小军， 薛盼盼， 陈舒婷， 高慧倩， 封少龙

(1.南华大学衡阳医学院公共卫生学院，湖南省衡阳市 421001；2.桂林医学院公共卫生学院预防医学研究所，广西壮族自治区桂林市 541199)

人工纳米颗粒通过各种途径暴露于人体，其潜在的健康危害受到了普遍关注，同时也是当前环境医学研究的前沿领域[1-2]。二氧化硅纳米颗粒(silica nanoparticles，SiNP)透过人体的多种生理屏障，进入血流，直接暴露于心血管系统，因此，其对心血管系统的潜在危害成了人们的重要关注点[1]。本课题组前期研究发现，SiNP可致人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)损伤与凋亡[1,3]，但其可能的分子机制尚不清楚。

现代医学研究表明，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是内外环境因素导致细胞凋亡的重要途径，也是心血管疾病发生发展的重要病理机制[4-6]。但SiNP是否可以诱导HUVEC的ERS和激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)尚不清楚。本文研究SiNP对HUVEC ERS的影响，并探讨其可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

SiNP购于江苏先丰纳米公司；胎牛血清购于南美Gibco公司；DMEM高糖培养基购于美国Hyclone公司；青/链霉素(双抗)、胰蛋白酶购于北京索莱宝公司；蛋白定量试剂盒购于康为世纪；β-actin抗体购于美国Proteintech公司；蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、磷酸化PERK(phosphorylated PERK，p-PERK)、肌醇需求激酶1α(inositol-requiring protein 1α，IRE1α)、磷酸化IRE1α(phosphorylated IRE1α，p-IRE1α)、激活转录因子-6(activating transcription factor-6，ATF-6)、剪切型X-盒结合蛋白1(spliced X-box binding protein 1，XBP1s)、结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein，Bip)、Calnexin、蛋白质二硫化物异构酶(protein disulfide isomerases，PDI)、真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)、磷酸化eIF2α(phosphorylated eIF2α，p-eIF2α)、激活转录因子-4(activating transcription factor-4，ATF-4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、磷酸化CHOP(phosphorylated CHOP，p-CHOP)、细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、内质网氧化还原蛋白1-Lα(endoplasmic reticulum oxidoreductin1-Lα，Ero1-Lα)、c-Jun氨基末端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinase1/2，JNK1/2)，磷酸化JNK(phosphorylated JNK，p-JNK)抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞培养

HUVEC由南华大学心血管疾病研究所提供。HUVEC在含10%胎牛血清、1%青/链霉素混合液和1% HEPES的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于后续试验。

1.3 免疫荧光检测

不同质量浓度(0、25、50、100 mg/L)SiNP处理HUVEC细胞24 h后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2次。0.4% TritonX-100处置20 min，PBS清洗2次，山羊血清工作液室温封闭20 min。抗目标蛋白的一抗孵育，于4 ℃冰箱过夜，PBS清洗2次。FITC标记的二抗避光室温孵育1 h，PBS清洗2次。DAPI避光孵育15 min，PBS清洗，荧光显微镜观察，并采集图片。

1.4 Western blotting

不同质量浓度(0、25、50、100 mg/L)SiNP处理HUVEC细胞24 h后，细胞裂解液冰上裂解细胞，收集蛋白，用于后续实验。蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后，电转移至PVDF膜上。经5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，把膜与抗目的蛋白的一抗4 ℃孵育过夜。次日，膜经TBST洗3次后，与相应的二抗室温孵育45 min，TBST洗膜3次。采用ECL发光液于化学发光凝胶成像分析系统(美国，Azure)显影成像。Image-J图像分析软件进行灰度值分析。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 SiNP诱导HUVEC内质网应激

与0 mg/L SiNP组比较，50、100 mg/L SiNP组PDI和100 mg/L SiNP组PERK蛋白及其磷酸化水平升高，而25、50、100 mg/L SiNP组的Bip、Calnexin、eIF2α蛋白及其磷酸化水平均升高且呈剂量-效应关系(P<0.01；图1、图2)。SiNP能诱导HUVEC的ERS。

图1 SiNP对HUVEC中Bip、Calnexin和PDI蛋白表达的影响A为Bip、Calnexin和PDI的蛋白条带；B为Bip、Calnexin和PDI蛋白表达水平柱状图。a为P<0.01，与0 mg/L SiNP组比较。

图2 SiNP对UPR中PERK eIF2α通路蛋白表达的影响A为目标蛋白的条带；B为PERK、eIF2α的磷酸化水平柱状图。a为P<0.01，与0 mg/L SiNP组比较。

2.2 SiNP诱导细胞内质网应激下游基因的表达

SiNP显著性增加下游标志性基因蛋白ATF-4、p-CHOP、Ero1-Lα、Cyt C的表达，并呈剂量-效应关系(P<0.01；图3)。细胞免疫荧光结果显示，ATF-4可进入细胞核，促进下游基因p-CHOP和Cyt C的表达(图3)。

图3 SiNP诱导细胞内质网应激下游基因的表达A为ATF-4的表达与细胞定位(荧光染色，200×)；B为ATF-4、p-CHOP、Ero1-Lα、Cyt C的蛋白条带；C为ATF-4、p-CHOP、Ero1-Lα、Cyt C蛋白表达水平柱状图。a为P<0.01，与0 mg/L SiNP组比较。

2.3 SiNP激活UPR中IRE1α通路

与0 mg/L SiNP组比较，50、100 mg/L SiNP组JNK磷酸化水平升高，而25、50、100 mg/L SiNP组IRE1α、XBP1s蛋白及磷酸化水平升高且呈剂量-效应关系(P<0.01；图4)。即SiNP可激活HUVEC的IRE1α通路。

图4 SiNP激活UPR中IRE1α通路A为IRE1α通路相关蛋白的条带；B为IRE1α通路相关蛋白表达与磷酸化水平柱状图。a为P<0.01，与0 mg/L SiNP组比较。

2.4 SiNP激活UPR中ATF-6通路

SiNP显著上调ATF-6的表达且呈现剂量-效应关系(P<0.01；图5)，即SiNP激活URP反应中的ATF-6通路。

图5 SiNP激活UPR中ATF-6通路A为ATF-6的表达与细胞定位(荧光染色200×)；B为ATF-6蛋白条带；C为ATF-6的相对表达柱状图。a为P<0.01，与0 mg/L SiNP组比较

3 讨 论

本文结果表明，SiNP可以诱导HUVEC内ERS的生物标志物Bip和Calnexin的表达上调，激活UPR的负反馈调节通路PERK通路，并促进ERS的3个经典途径ATF-4、IRE1α和ATF-6通路及其下游关键基因蛋白CHOP、Ero1-Lα、Cyt C的表达。提示SiNP可以诱导HUVEC内ERS反应。而促凋亡活性物质Cyt C表达升高，也表明SiNP诱导HUVEC凋亡。

SiNP被细胞内吞后，常定位于内质网[7]。其中，定位于内质网的SiNP可能影响内质网微环境，而干扰其对合成蛋白质的折叠，进而触发UPR[8-9]。当内质网内存在大量未折叠蛋白后，细胞常升高内质网内伴侣蛋白Bip、Calnexin和PDI等ERS的内在标志物的表达，以便促进内质网内蛋白的折叠[10]。SiNP升高内质网内Bip、PDI、Calnexin表达后，内质网内的未折叠蛋白理论上应该减少，ERS反应应该逐渐减弱，但由于SiNP是细胞不能降解的颗粒物，其在内质网中长期存在，就会干扰内质网微环境，影响蛋白质折叠，从而诱导UPR反应。持续的UPR反应则促进ERS的经典通路被激活，进而高表达促凋亡活性物质Cyt C，促进细胞凋亡[10-11]。研究表明，持续的ERS导致的细胞死亡需由CHOP介导[12]。其中，环境污染物通过CHOP介导的细胞凋亡与蛋白质的合成增加有关[13]。SiNP通过诱导ERS途径致HUVEC凋亡提供了理论基础，而本课题组前期结果[1]及本研究结果从试验的角度证实了这一假设。

综上所述，SiNP能致HUVEC氧化遗传损伤、ERS和凋亡，对心血管系统的健康具有潜在的风险。