基于葡萄有机酸的稀有人参皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的绿色制备

张浩然，朱小涵，赵 迅，李 玲，成乐琴*

(1.吉林化工学院 化学与制药工程学院,吉林 吉林 132022；2.吉林省长春市公安司法鉴定中心，吉林 长春 130000；3.通化百奥金森生物科技有限公司，吉林 通化 134000)

人参在东亚国家作为一种预防和滋补剂已有几千年的历史，是一种广受欢迎的草药，在癌症、心血管、免疫和中枢神经系统疾病等领域有多种药用功效[1-3].人参包含人参皂苷、人参多肽、人参多糖等成分[4]，其中人参皂苷因其在抗炎、抗应激、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等方面的良好作用得到了广泛的研究[5-8].原人参皂苷主要由Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1组成，占人参总皂苷含量的90%[9]，而大量研究表明，通过原人参皂苷的结构转化得到的次级稀有人参皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5在抗癌、抗炎、改善记忆力等[10-13]方面显示出更强的药理活性，具有更大的药用价值，因此稀有皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的制备具有重要意义.

稀有人参皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5可从红参或黑参中分离[14-15]，但红参或黑参加工时间长，稀有皂苷含量偏低.目前常用制备方法主要有酸水解法、微生物转化法及酶催化法[16-18]，其优点是可以提高稀有人参皂苷的收率和选择性，但成本高或环境不友好.

葡萄是世界上种植最广泛的一种大宗水果，含有较丰富的酒石酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸[19].在前期研究天然柠檬汁催化人参须根粉制备20(S,R)-Rg3和Rg5工艺[20]基础上，本文以葡萄汁作为酸的来源，以自制改良索氏提取器作为提取装置，研究从人参须根粉一步制备稀有人参皂苷Rg3、Rg5的方法，并进行工艺条件优化，为保健食品和功能性食品的研发提供更绿色、更价廉的原料支持.

1 原料与方法

1.1 原料和试剂

葡萄，吉林市大润发超市购买，使用前榨汁、过滤；人参须根，吉林市高仕奇参茸店；甲醇(色谱纯)，天津市大茂化学试剂厂；乙腈(色谱纯)，Tedia company，U.S.；无水乙醇(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司.

1.2 主要仪器与设备

改良索氏提取器，自制(结构见实用新型专利ZL201720660247.5)；高效液相色谱仪(EC2000)，大连依利特分析仪器有限公司；色谱柱(Pinnacle Ⅱ C18)，Restek U.S.；旋转蒸发仪(RE202)，日本Yamato；磁力搅拌器(ZNCL-GS 130*60)，巩义市予华仪器有限责任公司；高速台式离心机(H1650)，长沙湘仪离心机仪器有限公司.

1.3 实验原理

由人参须根粉制备稀有人参皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的实验原理见图1.

图1 稀有人参皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的制备原理

1.4 实验方法

1.4.1 单因素实验优化工艺条件

在改良索氏提取器的提取筒中放入2 g过100目筛人参须根粉，在提取筒和提取瓶中分别加入20 mL不同浓度的乙醇水溶液，提取瓶中再加入新鲜葡萄汁，放入搅拌子，安装改良索氏提取器.将装置中的提取瓶置于油浴中，并在提取筒中通入事先加热到特定温度的导热液，在300 rpm搅拌下加热搅拌提取.当提取筒出现回流液时打开提取筒下端活塞，至提取剂流入提取筒的速度和提取液流出提取筒的速度基本达到平衡.提取结束，打开提取筒下端活塞，合并提取筒和提取瓶中液体.人参提取物按照文献[20]的方法进行后处理，经旋转蒸发仪旋干，溶于色谱醇甲醇超声溶解后经0.22 μm滤头过滤进行HPLC定量分析，并计算人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5的得率.

1.4.2 正交实验优化工艺条件

在单因素实验基础上，选取乙醇浓度(A)，油浴温度(B)，提取时间(C)3个因素进行L9(34)正交试验.因素与水平选择见表1.

表1 L9(34)正交试验因素与水平

1.4.3 HPLC分析条件

色谱柱：Pinnacle Ⅱ C18(4.6×250 mm,5 μm)；检测波长：203 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 m L/min；进样量：20 μL；流动相：乙腈(A)-纯净水(B)；梯度洗脱程序[21]：0.00～10.00 min，A：22%；10.00～20.00 min，A：22%；20.00～25.00 min，A：27%；25.00～45.00 min，A：31%；45.00～60.00 min，A：38%；60.00～65.10 min，A：52%；65.00～75.00 min，A：52%；75.00～77.00 min，A：55%；77.00～79.00 min，A：90%；79.00～115.00 min，A：22%.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验优化提取制备20(S,R)-Rg3、Rg5的工艺条件

2.1.1 乙醇浓度对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响

为了考察乙醇浓度对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响，分别以10%、20%、30%、40%、50%乙醇水溶液为提取溶剂，在葡萄汁用量为10 mL、提取筒温度60 ℃、油浴温度125 ℃条件下提取人参须根粉3 h.提取物的HPLC 定量分析结果见图2.

乙醇浓度/%图2 乙醇浓度对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响

由图2可知，乙醇浓度对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响非常显著.乙醇浓度过低时会影响提取溶剂的气化速度，溶剂循环减慢，从而影响对人参皂苷的动态提取效率；而乙醇浓度高时虽然有利于溶剂的循环提取，但由于水含量降低，会影响葡萄汁中有机酸电离H+，从而降低酸催化效果.实验结果表明，葡萄汁作用下用20%的乙醇作提取剂时人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5的得率最高.

2.1.2 提取筒温度对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响

为考察不同提取筒温度对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响，固定20%的乙醇水溶液为提取溶剂、葡萄汁用量10 mL、油浴温度125 ℃条件下，分别在30、40、50、60、70 ℃提取筒温度提取人参须根粉3 h，实验结果如图3所示.

提取温度/℃图3 提取筒温度对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响

由图3可见，提取筒温度在30～40 ℃时，人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5的总得率变化不大，但提取筒温度从40 ℃提高到60 ℃时，20(S,R)-Rg3、Rg5的总得率有明显增加，而进一步升高温度时反而有所下降.因此，在下面的实验中选择60 ℃提取筒温度进行了进一步的工艺优化.

2.1.3 油浴温度对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响

为了考察油浴温度对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响，在20%的乙醇水溶液为提取溶剂、葡萄汁用量为10 mL、提取筒温度60 ℃条件下，分别在105、115、125、135、145 ℃油浴温度提取人参须根粉3 h(见图4).

油浴温度/℃图4 油浴温度对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响

由图4可见，随着油浴温度的提高，人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5的得率也随之升高，当油浴温度为135 ℃时达到最大值1.41%，这与柠檬汁作用下的油浴温度相同[21].而油浴温度进一步提高时总得率明显下降，这一方面可能由于温度过高会影响Rg3、Rg5的稳定性，另一方面，油浴温度还会影响提取溶剂循环的速度，间接影响提取效率.

2.1.4 葡萄汁用量对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响

葡萄汁含有酒石酸、柠檬酸、苹果酸等有机酸，这些酸可以作为H+的来源催化人参皂苷的结构转化反应.为了探索葡萄汁用量对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响，以20%的乙醇水溶液为提取溶剂，分别加入5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mL葡萄汁，在提取筒温度60 ℃、油浴温度135 ℃条件下提取人参须根粉3 h(见图5).

葡萄汁用量/mL图5 葡萄汁用量对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响

实验结果表明，人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5的总得率在7.5～10.0 mL范围内随着葡萄汁用量的增加而增加，10.0～12.5 mL范围内几乎保持不变，进一步提高葡萄汁用量，总得率有所下降.这说明葡萄汁用量过少，酸催化能力低，总得率低；若过多，会导致稀有人参皂苷部分分解，也会使总得率下降，因此选择葡萄汁用量为10 mL进行了进一步的优化.

2.1.5 提取时间对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响

为考察不同提取时间对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响，以20%的乙醇水溶液为提取溶剂，在提取筒温度60 ℃、油浴温度135 ℃条件下分别提取人参须根粉1、2、3、4、5 h，结果见图6.

提取时间/h图6 提取时间对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响

提取时间对20(S,R)-Rg3、Rg5得率的影响显示规律性变化，在提取时间1～4 h范围内，20(S,R)-Rg3、Rg5的总得率随着提取时间的增加呈增长趋势，当提取时间进一步延长至5 h时，20(S)-Rg3的得率有所下降，20(R)-Rg3和Rg5的得率有所增加，而人参皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的总得率基本保持不变.

2.2 正交试验分析

在单因素实验的基础上，为了进一步优化实验条件，选取对人参皂苷20(S,R)-Rg3、Rg5得率影响较大的乙醇浓度(A)、油浴温度(B)和提取时间(C)3个因素，每个因素选取3个水平，并以Rg3、Rg5的总得率为考察指标，进行了L9(34)正交试验.正交试验结果见表2.

表2 L9(34)正交试验方案与结果表

极差R的大小可以衡量实验中各因素对人参皂苷20(S,R)-Rg3和Rg5的总得率的影响大小.由表2可知，A、B和C的极差R分别为0.86、0.36和0.84，说明影响20(S,R)-Rg3和Rg5总得率的因素主次顺序为A>C>B，即乙醇浓度(A)的影响最大，提取时间(C)的影响次之，油浴温度(B)的影响最小.最优实验方案为A1B1C1，即乙醇浓度20%、油浴温度145 ℃、提取时间5 h，此时经HPLC(见图7)定量分析结果显示，20(S,R)-Rg3和Rg5总得率可以达到2.29%.

保留时间/min图7 优化条件下人参须根粉提取物的HPLC分析图

葡萄汁作用下制备富含功能性成分的人参提取物与柠檬汁作用下制备富含功能性成分的人参提取物的优化工艺对比中可知，葡萄汁作酸催化剂的来源时比柠檬汁需要更低的乙醇浓度、更高的油浴温度和更长的提取时间.

3 结 论

采用鲜葡萄汁中所含有机酸作为酸催化剂，使用自制改良索氏提取器，通过一步法从人参须根粉制备得到了富含稀有人参皂苷Rg3、Rg5的人参提取物.对实验条件的优化结果表明，乙醇浓度对稀有人参皂苷Rg3、Rg5的制备影响最大，确立的优化条件为乙醇浓度20%、提取筒温度60 ℃、油浴温度145 ℃、葡萄汁用量10 mL、提取时间5 h，此时人参皂苷Rg3、Rg5总得率达到2.29%.

用葡萄汁催化制备稀有人参皂苷Rg3、Rg5，不仅过程绿色环保，营养成分流失少，提取物兼具葡萄和人参成分，且Rg3、Rg5等稀有人参皂苷富集，非常适合作保健食品和功能食品原料.