lncRNA XIST和miR-124在支气管哮喘患儿外周血单个核细胞中表达关系研究

齐莎莎 张国伟 孟凡威 付晓梅 张旭亚

支气管哮喘是常见的慢性炎症性呼吸系统疾病，在婴幼儿时期即可发病[1]。随着经济快速的发展和环境污染问题的日益严重，哮喘发病率有逐渐上升的趋势，严重影响儿童生命健康及家庭生活质量[2]。微小RNA-124(microRNA-124，miR-124)是一种脑组织中特异性较高的miRNA，广泛参与神经系统发育[3]。长链非编码RNA X染色体失活特异性转录本(long non-coding RNA X inactive specific transcript，LncRNA XIST)是位于X染色体失活中心的XIST基因的转录产物[4]。Li等[5]研究结果显示，哮喘患者血浆中miR-124呈低表达，且本研究前期通过生物信息学预测网站(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测发现，LncRNA XIST与miR-124存在靶向关系。但目前关于lncRNA XIST、miR-124共同参与支气管哮喘的研究较少。因此，本研究通过检测支气管哮喘患儿外周血单个核细胞中lncRNA XIST、miR-124水平，探讨二者与肺功能指标及炎症因子的关系，以期为儿童支气管哮喘的预防和评估提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年1月至2021年3月因支气管哮喘于河南大学第一附属医院门诊及病房接受治疗的168例患儿为研究对象，其中急性发作期82例(急性发作组)、缓解期86例(缓解组)；同期选取84例健康体检儿童作为对照组。收集各组患儿年龄、性别、身体质量指数(body mass index，BMI)、哮喘家族史、病程等一般资料。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①患儿符合支气管哮喘诊断标准[6]；②3～13岁儿童，本试验经医院临床研究伦理委员会批准，所有受试儿童家长自愿参加研究，并签署知情同意书；③患儿临床资料完整，可配合治疗；④入组前4周无糖皮质激素应用史者。排除标准：①有感染性疾病、过敏性鼻炎、喘息性疾病、因感染引起的咳喘及其他呼吸系统疾病者；②有β2受体激动剂过敏史者；③有银屑病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病者。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及处理 采集各组儿童清晨空腹外周静脉血。①血清收集：部分离心15 min后收集血清，用于炎症因子检测；②外周血单个核细胞收集：部分加同等体积生理盐水，混匀后加入到含有人外周血淋巴细胞分离液的离心管中，离心30 min后取出，此时离心管最上层为血浆，血浆层下白色薄层为外周血单个核细胞层，收集单个核细胞层，离心后弃上清，收集乳白色细胞，并采用PBS缓冲液洗涤，用于lncRNA XIST、miR-124水平检测。

1.3.2 外周血单个核细胞lncRNA XIST和miR-124水平检测 RNA提取试剂盒(北京伊塔生物科技有限公司)提取总RNA后反转录得cDNA，采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法检测各组外周血单个核细胞中lncRNA XIST、miR-124水平。qRT-PCR反应条件：95℃，5 min；95℃、30 s，63℃、30 s，40个循环；72℃，10 min。qRT-PCR反应体系：上下游引物(10 μM)各0.5 μL，AceQ qPCR SYBR®Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，ddH2O 3.0 μL。lncRNA XIST、miR-124及其内参引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法对外周血单个核细胞lncRNA XIST、miR-124水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 肺功能指标、炎症因子水平检测 采用肺功能仪(北京西化仪科技有限公司)检测各组患儿第一秒用力呼气量(forced expiratory volume in one second，FEV1)。采用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测各组儿童炎症因子白介素(interleukin，IL)-17、IL-1β、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平。其中IL-17 ELISA试剂盒购自南京北鱼生物科技有限公司，IL-1β ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒购自上海瓦兰生物科技有限公司；IL-10 ELISA试剂盒购自美国Sciencell公司。

2 结果

2.1 对照组、缓解组、急性发作组一般资料比较 对照组、缓解组、急性发作组年龄、性别、BMI、哮喘家族史比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与缓解组比较，急性发作组病程较短，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 对照组、缓解组、急性发作组一般资料比较

2.2 对照组、缓解组、急性发作组外周血单个核细胞lncRNA XIST和miR-124水平比较 与对照组比较，缓解组、急性发作组外周血单个核细胞lncRNA XIST水平升高，miR-124水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与缓解组比较，急性发作组外周血单个核细胞lncRNA XIST水平升高，miR-124水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 对照组、缓解组、急性发作组外周血单个核细胞lncRNAXIST和miR-124水平比较

2.3 对照组、缓解组、急性发作组肺功能指标、炎症因子水平比较 与对照组比较，缓解组、急性发作组IL-17、IL-1β、TNF-α水平升高，FEV1、IL-10水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与缓解组比较，急性发作组IL-17、IL-1β、TNF-α水平升高，FEV1、IL-10水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 对照组、缓解组、急性发作组肺功能指标、炎症因子水平比较

2.4 支气管哮喘患儿外周血单个核细胞lncRNA XIST与miR-124水平相关性 Pearson法相关性分析结果显示，支气管哮喘患儿外周血单个核细胞lncRNA XIST与miR-124水平呈负相关(r=-0.668，P<0.001)。见图1。

图1 支气管哮喘患儿外周血单个核细胞lncRNA XIST与miR-124水平相关性

2.5 支气管哮喘患儿lncRNA XIST、miR-124与肺功能指标、炎症因子水平相关性 Pearson法分析结果显示，支气管哮喘患儿lncRNA XIST与IL-17、IL-1β、TNF-α呈正相关(P<0.05)，与FEV1、IL-10呈负相关(P<0.05)。miR-124与FEV1、IL-10呈正相关(P<0.05)，与IL-17、IL-1β、TNF-α呈负相关(P<0.05)。见表5。

表5 支气管哮喘患儿lncRNA XIST、miR-124与肺功能指标、炎症因子水平相关性

3 讨论

哮喘是世界范围内常见的难治性慢性疾病之一，儿童支气管哮喘的预防和治疗也成为世界性的医学课题[7]。研究[8]表明，支气管哮喘是多种组分、多种细胞共同参与、共同作用的结果。支气管哮喘发病时多表现为咳嗽、呼吸困难、反复发作性喘息，但其病因复杂，具体发病机制目前尚不十分清楚，增加了临床诊疗难度[9]。因此，急需寻找相关的生物标志物用于支气管哮喘的临床诊治。

LncRNA是一类缺少完整阅读框的非编码RNA，对基因表达、细胞分化以及炎症反应均有重要影响[10]。lncRNA XIST是哺乳动物X染色体失活时的关键起始物，研究发现其在乳腺癌、膀胱癌等肿瘤中表达失调[11-12]。lncRNA XIST在炎症性疾病中的作用有待进一步探究。miRNA是一类高度保守的单链、非编码RNA，参与细胞增殖、发育、代谢等一系列生理过程，miRNA同时还是促炎细胞因子的重要调节因子[13]。miR-124在中枢神经系统中的表达量较高，其在神经细胞损伤及神经炎症中发挥重要调节作用[14]。本研究结果中显示，与健康儿童相比，支气管哮喘患儿外周血单个核细胞lncRNA XIST水平升高，miR-124水平降低，且随哮喘疾病活动度的增加，其变化趋势更为明显。Atashbasteh等[15]研究显示，与健康人群比较，哮喘患者血清中miR-124表达下调，与本研究中miR-124表达趋势基本一致。提示本研究lncRNA XIST、miR-124表达水平可能与儿童支气管哮喘的发生发展有关。研究显示，miR-124与变应性鼻炎的疾病风险、严重程度及炎症相关，且miR-124可通过调控Toll样受体相关通路中因子表达水平，发挥抗炎作用[16-17]。结合生物信息学预测结果中二者的靶向关系及上述研究[16-17]中miR-124在炎症疾病中的作用机制推测：哮喘病理发展初期，lncRNA XIST表达水平升高，通过负向调节miR-124使其表达下降，miR-124无法抑制Toll样受体相关通路中IL-1受体相关激酶1和TNF受体相关因子6的表达，使得其下游核因子-κB活化增加，造成miR-124抗炎作用被抑制，参与支气管哮喘的疾病进程，导致患儿病情加重。此外，本研究中lncRNA XIST与miR-124表达水平呈明显负相关。而Li等[5]研究中显示，lncRNA NEAT1与miR-124在哮喘患儿血清中表达呈负相关。推测在哮喘发病过程中miR-124的表达可能受不同的基因调控，进而在哮喘疾病的发生发展中发挥重要作用。

相关研究[18-19]显示，炎症反应在支气管哮喘的病理学机制中起重要作用，IL-17、IL-1β、TNF-α、IL-10等炎症因子可能是导致支气管哮喘患儿气道症状出现的直接因素。而本研究中与健康儿童比较，支气管哮喘患儿IL-17、IL-1β、TNF-α水平升高，FEV1、IL-10水平降低，且随支气管哮喘活动度增加，IL-17、IL-1β、TNF-α水平依次升高，FEV1、IL-10水平依次降低。提示支气管哮喘患儿呼吸道炎症水平相对较高，且肺功能可能受损。此外，本研究结果中lncRNA XIST、miR-124与肺功能指标及炎症因子均呈一定的相关性。而廖伟荣等[20]研究同样显示lncRNA NEAT1/miR-124轴表达量与哮喘患儿肺通气功能及炎症水平相关。本研究中lncRNA XIST可能通过负向调节miR-124表达，使其表达水平降低，miR-124调控炎症的作用降低，进而影响患儿肺功能及其病情进展。

综上所述，支气管哮喘患儿外周血单个核细胞lncRNA XIST高表达，miR-124低表达，且二者与肺功能指标FEV1及炎症因子IL-17、IL-1β、TNF-α、IL-10均呈一定的相关性。lncRNA XIST、miR-124可能通过影响炎症反应进而影响支气管哮喘的病情进展，提示临床重视哮喘患儿lncRNA XIST、miR-124的水平变化，为今后哮喘的治疗及预防提供了新的靶点和思路。本研究仍存在不足之处：本研究仅从临床水平上探究了lncRNA XIST、miR-124在支气管哮喘患儿外周血单个核细胞中的表达情况，今后将进一步进行体外细胞或动物实验研究证实相关机制；且本研究纳入病例数有限，所有样本均来自同一家医院，为单中心研究，且部分干扰因素未能排除，今后将排除其他各类干扰因素，进一步采用大样本量、多中心的前瞻性研究验证实验结果。