澜沧裂腹鱼4个地理群体遗传多样性分析

金方彭，左鹏翔，冷 云，吴俊颉，熊合勇，高海涛，雷春云，周 睿，李光华

( 1.云南省渔业科学研究院，云南 昆明 650000；2.华能澜沧江水电股份有限公司，云南 昆明 650000 )

澜沧裂腹鱼(Schizothoraxlantsangensis)，俗称面鱼，属鲤形目鲤科裂腹鱼亚科裂腹鱼属，为高原山区冷水性鱼类，分布于澜沧江中上游。分布区较狭窄，数量不多，已列为《中国物种红色名录第一卷》濒危物种[1]。近年来，由于澜沧江梯级水电站的开发建设导致流域出现片段化，阻碍了澜沧裂腹鱼的自然繁殖，导致自然资源量下降，而通过人工繁殖的方法进行资源量恢复的效果尚不明显。目前，国内外对澜沧裂腹鱼的研究较少，主要集中在繁殖生物学[2]、肌肉营养[3]等方面，有关澜沧裂腹鱼遗传多样性方面的报道较少。以高通量测序为基础的简化基因组测序(SLAF-seq)技术具有通量高、有效读长长、准确度高、重复性好、成本低等特点[4]。马海鑫[5]基于SLAF-seq技术对弧唇裂腹鱼(S.curvilabiatus)进行了群体遗传学分析，王凤娇等[6]基于SLAF-seq技术对中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)3个选育世代进行了遗传多样性分析，金方彭等[7]利用SLAF-seq技术对澜沧江中上游光唇裂腹鱼(S.lissolabiatus)4个地理群体进行了遗传多样性分析。笔者利用SLAF-seq技术获得大量特异性单核苷酸多态性标签，并利用开发的位点分析不同地理群体样品的遗传多样性，为澜沧裂腹鱼未来的种质选育提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在澜沧江中上游采集澜沧裂腹鱼野生群体40尾，划分为4个地理群体(表1)。取野生样本尾鳍，存放于无水乙醇中带回实验室后于-85 ℃冰箱保存。

表1 澜沧裂腹鱼样本采集点Tab.1 Sample collection sites of S. lantsangensis

1.2 DNA提取

采用异丙醇沉淀法，提取样本DNA。纯化后的DNA样品经琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计[D(260 nm)/D(280 nm)]检测合格。

1.3 建库及高通量测序

根据Sun等[8]方法构建SLAF-seq文库，笔者选取锦鲤(Cyprinuscarpiokoi)基因组作为酶切预测的参考基因组，其基因组大小为1.71 Gb，GC含量37.00%(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/951/615/GCF_000951615.1_common_carp_genome/GCF_000951615.1_common_carp_genome_genomic.fna.gz)，内切酶的选择原则是避免重复序列的内切酶片段且片段必须均匀地分布在基因组中，并使酶切片段数符合预期特异位点片断(SLAF)标签数。操作流程为:在酶切片段3′端加poly (A)、连接Dual-index专用测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶回收目的片段，并将目的片段使用Illumina Hiseq 2500进行双末端测序。选用日本晴水稻(Oryzasativassp.japonica)基因组(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)为对照组，并将同一过程进行排序以评估建库的准确性。

根据序列相似性特点，将各样品的读长进行聚类，聚在一起的读长来源于一个SLAF标签。不同SLAF标签间的相似度远低于同一SLAF标签在不同样品间的序列；一个SLAF标签在不同样品间序列有差异，即可定义为多态性SLAF标签。单核苷酸多态性(SNP)标记的开发是以每个 SLAF 标签中测序深度最高的序列类型作为参考序列，利用BWA[9]将测序读长比对到参考基因组上，并使用SAMtools[10]和GATK[11]方法开发SNP标记，最终以2种方法得到的SNP标记交集作为可靠的SNP标记数据集，利用群体内具有代表性的高质量SNP标记进行群体多态性分析。

1.4 数据处理

核酸多样性分析和4个群体间的遗传分化指数使用PopGenome[12]软件统计；遗传多样性参数和群体间分子变异分析使用Arlequin[13]软件统计；使用MEGA X[14]软件，基于邻接法，采用Kimura 2-parameter模型，构建各样品的系统发育树；通过admixture[15]软件，进行群体遗传结构分析；通过EIGENSOFT[16]软件，进行主成分分析，得到样品的聚类情况。

2 结果与分析

2.1 基础数据

2.1.1 建库评估与质控

通过锦鲤基因组进行方案预测，选择Rsa Ⅰ+Hae Ⅲ酶对澜沧裂腹鱼进行酶切，目标片段长度为364～414 bp，样本平均获得129 637个SLAF标签，SLAF标签在基因组上基本分布均匀，为保证项目分析质量，本项目采用读长126 bp×2作后续的数据评估和分析，共获得467.67 Mb读长数据，Control数据双端比对效率为97.19%，酶切效率为90.82%，测序Q30碱基含量平均为94.88%，GC含量平均为40.32%，所得到的Q30碱基质量值较高，说明碱基出错率低，测序结果可靠。读长比对率均大于70%，表明试验过程没有污染，插入片段长度呈正态分布(图1)，建库正常。

2.1.2 SLAF标签与SNP标记开发

研究获得498 199个SLAF标签，其中多态性SLAF标签有213 644个，标签的平均测序深度为29.36×。以每个SLAF标签中深度最高的序列类型作为参考序列，将测序读长比对到参考基因组上，共获得736 515个群体SNP位点，其中：SNP的完整度为3.48%～58.54%，平均为36.64%；SNP杂合度为4.03%～21.47%，平均为15.51%(表2)。

表2 澜沧裂腹鱼SLAF标签和SNP信息Tab.2 SLAF labels and SNP information of S. lantsangensis

2.2 遗传多样性分析

过滤掉4个群体中完整度小于0.5、第2等位基因频率小于0.05的SNP，用过滤后的SNP计算出各采样点的遗传多样性指数。4个地理群体的观测等位基因数、期望等位基因数、观测杂合度和期望杂合度(基因多样性)、根井正利基因多样性指数、香农—维纳多样性指数、多态信息含量均是黄登—大华桥地理群体最高(1.9653、1.5725、0.5032、0.3322、0.3430、0.4980、0.2655)；次要基因频率以苗尾—功果桥群体最高(0.2724)(表3)。对不同地理群体的观测等位基因数、期望等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、根井正利基因多样性指数、香农—维纳多样性指数、多态信息含量(PIC)作显著性差异分析，结果显示，F(664.6)>Fcrit(2.660)且P(-8.94)<0.05，呈显著差异。

表3 澜沧裂腹鱼4个地理群体遗传多样性指数Tab.3 Genetic diversity index of four geographical populations of S. lantsangensis

2.3 群体间遗传分化分析

2.3.1 群体间遗传距离

使用MEGA X 10.0.5软件计算群体间的遗传距离，所有样品的遗传距离为0.0323～0.8387，群体间遗传距离为0.1946～0.6235。群体间遗传分化指数计算结果(表4)表明，黄登—大华桥、苗尾—功果桥的分歧最大(0.0817)，黄登—大华桥、乌弄龙群体分歧最小(-0.0097)，平均为0.0242。平均显著水平P=0.2098>0.05，F(1.89)

表4 澜沧裂腹鱼遗传分化指数和遗传距离Tab.4 Genetic differentiation index and genetic distance of S. lantsangensis

2.3.2 群体聚类分析

从系统发育树来看，黄登—大华桥群体聚成一支，里底群体聚为一支，苗尾—功果桥群体聚为一支，乌弄龙和其他地理群体有交叉聚类的现象(图2)。总的看来，各地理群体的样本有交叉聚类的现象。

图2 对照序列插入片段分布Fig.2 Distribution of insert fragments of control sequences

图2 澜沧裂腹鱼系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of S. lantsangensis

2.3.3 不同群体之间分子变异分析

对4个地理群体的澜沧裂腹鱼的控制区序列进行分子生物学方差分析(AMOVA)，结果显示，群体遗传分化指数0.02915(P=0.00348<0.01)，表明澜沧裂腹鱼群体间存在小的但差异显著的遗传分化。其中群体间变异占2.91%，群体内的变异占97.09%，表明这些样品的遗传分化主要发生在群体内部(表5)。

3 讨 论

3.1 澜沧裂腹鱼遗传多样性分析

多态性信息含量可以反映出位点在群体中的多样性水平：当多态性信息含量>0.5时，为高度多态性位点；当0.25<多态性信息含量<0.5时，为中度多态位点；当多态性信息含量<0.25时，为低度多态位点[17]。本研究中，澜沧裂腹鱼不同地理群体的多态性含量大小依次为黄登—大华桥(0.265)>里底(0.2499)>乌弄龙(0.2463)>苗尾—功果桥(0.1709)，除黄登—大华桥地理群体呈中度多态性外，其他3个地理群体均呈低度多态性。

杂合度是群体在所检测位点上的杂合子频率，可以衡量一个群体杂合程度的高低。杂合度和遗传多样性与群体对环境的适应能力正相关[18]。本研究中，澜沧裂腹鱼观测杂合度和期望杂合度均是黄登—大华桥地理群体最大(0.5032、0.3322)苗尾—功果桥地理群体最小(0.1550、0.2133)。澜沧裂腹鱼4个地理群体的平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.3692、0.2909：与同一水系同属的光唇裂腹鱼(0.2695、0.2892)相比较[19]，杂合度较高；与同属的短须裂腹鱼(0.2007、0.3160)[20]相比较，观测杂合度偏高，期望杂合度较低。这表明其对环境的适应能力可能稍弱。

根井正利基因多样性指数是衡量群落丰富度的指标，该指数越高，群落越稳定；香农—维纳多样性指数是用来反应群体的多样性程度的指数，指数越大，多样性越高[21]。在本次研究中，澜沧裂腹鱼4个地理群体的平均根井正利基因多样性指数和香农—维纳多样性指数分别为0.3137、0.4367，说明澜沧裂腹鱼的4个群体多样性指数低，群体不是很稳定：与同水系同属的光唇裂腹鱼(0.3134、0.4628)[7]相比，平均根井正利基因多样性指数偏高，香农—维纳多样性指数偏低；与同属的短须裂腹鱼(0.3386、0.4827)[20]相比，根井正利基因多样性指数和香农—维纳多样性指数均较低，说明澜沧裂腹鱼群体多样性偏低。4个地理群体中，黄登—大华桥根井正利基因多样性指数和香农—维纳多样性指数最高(0.3430、0.4980)，苗尾—功果桥根井正利基因多样性指数和香农—维纳多样性指数最低(0.2466、0.3187)，说明黄登—大华桥地理群体遗传多样性最高，苗尾—功果桥地理群体的遗传多样性最低。

3.2 变异位点分析

澜沧裂腹鱼4个地理群体的遗传变异的分子生物学方差分析结果显示，群体间的变异占2.91%，群体内的变异占97.09%。这表明遗传分化主要发生在每个群体内部，群体间遗传分化程度低，与遗传分化指数分析结果相吻合。与同水系的光唇裂腹鱼(群体间变异占89.73%，群体内变异占10.27%)相比[7]，群体内变异程度偏高，群体间的变异程度没有光唇裂腹鱼高；与用同一种标记方法分析的罗氏沼虾(群体内变异占73.67%，群体间变异占26.33%)[21]相比较，澜沧裂腹鱼群体间变异程度低；与同属的塔里木裂腹鱼(群体内变异81.01%，群体间变异占16.68%)[22]相比较，澜沧裂腹鱼群体内变异程度稍高，但群体间的变异程度教低；与雅砻江长丝裂腹鱼(S.dolichonema)群体(群体内变异占84.84%，群体间变异占15.16%)[23]相比较，澜沧裂腹鱼群体内变异程度高，群体间变异程度较低。这可能与所用测序方法不同有关系。

3.3 遗传分化分析

研究表明：当0.05<遗传距离<0.3时为同种不同群体；0.3<遗传距离<0.9时为同属不同种；遗传距离>0.9为不同属[21]。本研究中40个样本的遗传距离为0.0323～0.2588，说明研究对象为同种不同群体。根据评价标准：当0<遗传分化指数<0.05时，表现为低等分化水平；当0.05<遗传分化指数<0.15时，表现为中等分化水平；当遗传分化指数>0.15时，表现为高等分化水平[17,24]。本研究中，群体间遗传分化指数为-0.01496～0.12985：与同属的墨脱裂腹鱼(S.molesworthi)[25](遗传分化指数-0.014～0.771)相比较，遗传分化指数较低，可能与标记的方法不同有关；与用同一种标记方法的罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)[26](遗传分化指数0.045～0.363)相比较，遗传分化指数较低。群体间分化指数均值为0.07629，分化程度处于中等水平。除苗尾—功果桥、乌弄龙、黄登—大华桥3个群体间分化处于低等水平外，其他群体间分化均处于中等水平。

聚类分析结果表明，黄登—大华桥地理群体聚成一支，里底地理群体聚为一支，苗尾—功果桥聚为一支，乌弄龙和其他地理群体有交叉聚类的现象，各地理群体的样本有交叉聚类的现象。这可能是这些年来增殖放流引起的，因为黄登鱼类增殖站负责大华桥、黄登、里底和乌弄龙几个电站的鱼类增殖放流任务，且在2012年黄登鱼类增殖站运行之初，并未人工繁殖成功，放流所需鱼苗是从下游功果桥增殖站调运的鱼苗，以完成放流工作，从而引起不同地理群体交叉聚类。

3.4 澜沧裂腹鱼保护建议

遗传多样性是物种进化的基础，丰富的遗传多样性在维持物种的种群数量和环境适应能力方面发挥很大的作用。鱼类在河流生态系统中扮演着重要的角色，对于保持生态系统正常循环与能量流动起着重要作用[26]，水利工程开发和建设都会对鱼类群体结构及遗传多样性分布造成不同程度的影响，进而影响生态系统的稳定性[27-28]。笔者对澜沧裂腹鱼的遗传多样性进行评估发现，其群体遗传多样性偏中下水平，群体内的变异程度远远高于群体间，梯级水电工程建设可能阻断了群体间的遗传交流，促进了这种遗传分化现象的发展。建议澜沧江中上游流域应当加大云南土著鱼类资源监控力度，水电站因地制宜地修筑过坝设施，增强人工增殖放流的质量和力度。

4 结 论

研究结果显示：在黄登—大华桥、里底、乌弄龙和苗尾—功果桥4个地理群体中，观测等位基因数和期望等位基因数分别为1.90～1.97和1.36～1.57；观测杂合度和期望杂合度的分别为0.16～0.50和0.21～0.33；根井正利基因多样性指数和香农—维纳多样性指数分别为0.25～0.34和0.32～0.50；多态信息含量依次为0.2655、0.2499、0.2463、0.1709，处于中低等多态水平；最小等位基因频率依次为0.2653、0.2579、0.2561、0.2724；所有遗传多样性指数中，以黄登—大华桥群体最高且呈差异显著(P<0.05)；群体间的变异占2.91%，群体内的变异占97.09%，说明变异多发生在群体内，群体间的变异程度小；群体间遗传距离为0.1946～0.6235，群体间的遗传分化指数为-0.019～0.0817，4个地理群体出现交叉聚类的现象。